SIST ISO 15819:2015

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15819
Second edition
2014-10-15
Cosmetics — Analytical
methods — Nitrosamines:
Detection and determination of
N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in
cosmetics by HPLC-MS-MS
Cosmétiques — Méthodes analytiques — Nitrosamines: Recherche
et dosage de la N-nitrosodiéthanolamine (NDELA) dans les produits
cosmétiques par CLHP-SM-SM
Reference number
©
ISO 2014
© ISO 2014
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Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle . 1
4 Reagents . 2
5 Apparatus . 2
6 Sample preparation and conservation . 3
6.1 General . 3
6.2 Standard solutions preparation . 3
6.3 Sample preparation . 4
7 Procedure. 5
7.1 General . 5
7.2 Chromatographic conditions . 5
7.3 HPLC-MS-MS conditions . 6
8 Calculation of results . 7
8.1 Determination of the R value . 7
8.2 Calibration curve . 7
8.3 Validity check procedure and its criteria . 7
8.4 Calculation of concentrations . 7
9 Test report . 8
Annex A (informative) Examples of a calibration curve and of chromatograms .9
Bibliography .11
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 217, Cosmetics.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 15819:2008), which has been
technically revised.
iv © ISO 2014 – All rights reserved

Introduction
Human exposure to N-nitrosamines can occur through diverse sources such as environment, food, or
personal care products. As a result of their perceived carcinogenic potential on several animal species,
minimization of exposure to N-nitrosamines is recognized as important to the preservation of human
health. Among N-nitrosamines, N-nitrosodiethanolamine (NDELA) has been recognized as a potential
contaminant of cosmetics.
In this context, several analytical methods have been developed to detect and determine its presence
in cosmetics, such as gas chromatography/thermal energy analysis, high performance liquid
chromatography (HPLC) coupled either with photolysis and colourimetric quantification or with mass
spectrometry (MS) determination. This latter method uses advanced technology to ensure the maximum
specificity towards NDELA, to minimize the risk of artefactual formation of the analyte of interest and
to allow precise quantification.
This analytical method uses high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry
to separate and detect trace levels of NDELA from a cosmetic ingredient or product matrix with
maximum specificity for NDELA.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 15819:2014(E)
Cosmetics — Analytical methods — Nitrosamines:
Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine
(NDELA) in cosmetics by HPLC-MS-MS
1 Scope
This International Standard describes a method for the detection and quantification of
N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics and raw materials used in cosmetics.
This method is not applicable to the detection and/or quantification of nitrosamines other than NDELA
nor to the detection and/or quantification of NDELA in products other than cosmetics or raw materials
used in cosmetics.
If a product has a possibility of either NDELA contamination from ingredients or NDELA formation by
the composition of ingredients, the method is intended to be applied for quantitative determination of
NDELA. Accordingly, the method does not apply to routine testing of cosmetic products. Because of the
large variety of cosmetic products within this field of application, this method might need to be adapted
for certain matrices (refer to ISO 12787).
Therefore, International Standards dedicated to alternative methods for testing nitrosamines in cosmetic
products are being developed separately. Other methods can be employed provided that they are verified
as to their detection of NDELA and validated in terms of recovery and quantification of the analyte.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 12787:2011, Cosmetics — Analytical methods — Validation criteria for analytical results using
chromatographic techniques
3 Principle
Extraction of NDELA in cosmetics samples is carried out with water in the presence of deuterated d8-
NDELA used as internal standard (IS). Clean-up is performed either using solid phase extraction (SPE
clean-up, see 6.3.1) with a C18 cartridge or liquid–liquid extraction using dichloromethane (DCM clean-
up, see 6.3.2) when the samples are not dispersible in water. The extracts are analysed by HPLC-MS-MS
(high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometric detection).
Identification of NDELA is carried out by using the molecular ion and two diagnostic ions. NDELA
quantification is done by comparing the ratio of the major fragment ions of NDELA and d8-NDELA with
the calibration curve.
In accordance with the ISO 12787, the absence of NDELA in the sample could be confirmed with a second
analysis. A spiked preparation at a target value could be performed to evaluate the limit of detection of
NDELA in the sample.
If matrix effect is observed with significant impact on the performance of the method (sensitivity,
accuracy, etc.) for specific cosmetic product, standard addition calibration procedures could be utilized
(refer to ISO 12787).
4 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and only
distilled water or water of grade 1 in accordance with ISO 3696:1987. Solvents shall be of a suitable
quality for HPLC-MS.
4.1 Methanol (MeOH), HPLC-MS grade.
4.2 Ethanol (EtOH), HPLC-MS grade.
4.3 Dichloromethane (DCM), HPLC-MS grade.
4.4 N-nitrosodiethanolamine, with known purity greater than 95 %.
4.5 d8-N-nitrosodiethanolamine, with known purity greater than 95 %.
4.6 Ammonium acetate (NH Ac), analytical grade (suitable for HPLC-MS).
4.7 1 mol/l ammonium acetate solution, for the preparation of 1,0 l, dissolve 77,08 g of NH Ac in
1,0 l of water.
4.8 Eluent A: 2 mmol NH Ac in water, for the preparation of 1,0 l, by taking 2 ml of 1 mol/l NH Ac
4 4
(4.7) and making up to 1 l with water.
4.9 Eluent B: 2 mmol NH Ac in 90 / 10 MeOH / water v/v, formed, for the preparation of 1,0 l, by
taking 2 ml of 1 mol/l NH Ac (4.7) and making up to 1 l with mixture of 90/10 MeOH / water v/v.
5 Apparatus
Use standard laboratory glassware and equipment, with the addition of:
5.1 Vortex mixer.
®1)
5.2 Sample processing station, in SPE application [such as Vacmaster ] sample processing station.
5.3 High speed centrifuge (ideally 20 000 G).
NOTE If centrifuge speed below 20 000 G is used, pay attention to possible clogging problem during the SPE
clean-up process. If necessary, additional filtration step with 0,2 µm pore size membrane filter could be added.
®1)
5.4 Solid phase extraction columns, e.g. Bakerbond C18 — 6 ml, 500 mg reversed phase
octadecylsilane bonded to silica gel, 40 APD (Average Particle Diameter), 60 Å.
5.5 HPLC-MS-MS equipment.
5.5.1 High performance liquid chromatography apparatus, consisting of an eluent reservoir, a
pump, an injection system, a data processor, e.g. an integrator with plotter, coupled with tandem mass
spectrometry using electrospray ionization.
® ®
1) Vacmaster and Bakerbond are examples of suitable products available commercially. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these
products.
2 © ISO 2014 – All rights reserved

2) ®
5.5.2 Analytical r
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15819
Deuxième édition
2014-10-15
Cosmétiques — Méthodes analytiques
— Nitrosamines: Recherche et dosage
de la N-nitrosodiéthanolamine
(NDELA) dans les produits
cosmétiques par CLHP-SM-SM
Cosmetics — Analytical methods — Nitrosamines: Detection and
determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics
by HPLC-MS-MS
Numéro de référence
©
ISO 2014
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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Tel. + 41 22 749 01 11
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés

Contents Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Principe . 1
4 Réactifs . 2
5 Appareillage . 2
6 Préparation et conservation d’échantillons . 3
6.1 Généralités . 3
6.2 Préparation des solutions étalons . 4
6.3 Préparation de l’échantillon . 5
7 Mode opératoire. 6
7.1 Généralités . 6
7.2 Conditions chromatographiques . 6
7.3 Conditions CLHP-SM-SM . 7
8 Calcul des résultats . 7
8.1 Détermination de la valeur R . 7
8.2 Courbe d’étalonnage . 7
8.3 Mode opératoire de vérification de la validité et ses critères . 8
8.4 Calcul des concentrations . 8
9 Rapport d’essai . 8
Annexe A (informative) Exemples d’une courbe d’étalonnage et de chromatogrammes .10
Bibliographie .12
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 217, Cosmétiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 15819:2008), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés

Introduction
L’exposition humaine aux N-nitrosamines peut se produire au contact de sources diverses présentes
dans l’environnement, la nourriture ou les produits de soin personnels. Ces substances ayant montré un
effet cancérigène notoire sur plusieurs espèces animales, il est reconnu qu’une restriction d’exposition
aux N-nitrosamines est d’une importance primordiale pour la préservation de la santé humaine. Parmi
les N-nitrosamines, il a été établi que la N-nitrosodiéthanolamine (NDELA) est un contaminant potentiel
des cosmétiques.
Dans ce contexte, plusieurs méthodes analytiques ont été développées pour rechercher et doser sa
présence dans les cosmétiques, comme la chromatographie en phase gazeuse avec analyse d’énergie
thermique, la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) couplée soit à une photolyse
avec quantification colorimétrique soit à une détermination par spectrométrie de masse (SM). Cette
dernière méthode nécessite l’usage de techniques avancées pour garantir une spécificité maximale dans
la recherche de la NDELA, afin de limiter le risque de formation artefactuelle de l’analyte considéré et de
permettre une quantification précise de la substance.
La présente méthode analytique emploie la chromatographie en phase liquide à haute performance
couplée à la spectrométrie de masse afin de séparer et de rechercher la NDELA à l’état de trace dans un
ingrédient ou dans une matrice de produit cosmétique, avec une spécificité maximale pour la NDELA.
NORME INTERNATIONALE ISO 15819:2014(F)
Cosmétiques — Méthodes analytiques — Nitrosamines:
Recherche et dosage de la N-nitrosodiéthanolamine
(NDELA) dans les produits cosmétiques par CLHP-SM-SM
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode de recherche et de quantification de la
N-nitrosodiéthanolamine (NDELA) dans les cosmétiques et les matières premières utilisées dans
les cosmétiques.
La présente méthode n’est applicable ni à la recherche et/ou à la quantification de nitrosamines autres
que la NDELA, ni à la recherche et/ou à la quantification de la NDELA dans les produits autres que les
cosmétiques ou les matières premières utilisées dans les cosmétiques.
Si un produit peut être contaminé par la NDELA à partir de ses ingrédients ou que la composition
d’ingrédients cosmétiques peut entraîner la formation de NDELA, alors la méthode sera appliquée pour
la détermination de la quantité de NDELA. Par conséquent, cette méthode ne s’applique pas aux essais
de routine relatifs aux produits cosmétiques. En raison du large éventail de cosmétiques considéré dans
ce domaine d’application, la présente méthode pourrait nécessiter d’être adaptée à certaines matrices
(se référer à l’ISO 12787).
Par voie de conséquence, les Normes internationales consacrées à d’autres méthodes d’essai des
nitrosamines dans les cosmétiques sont élaborées séparément. D’autres méthodes peuvent être
employées à condition que la recherche de NDELA ait été vérifiée et que ces méthodes soient validées en
termes de récupération et de quantification de l’analyte.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 12787:2011, Cosmétiques — Méthodes analytiques — Critères de validation pour les résultats
analytiques utilisant des techniques chromatographiques
3 Principe
L’extraction de la NDELA des échantillons cosmétiques est réalisée avec de l’eau en présence de d8-NDELA
deutérée utilisée en tant qu’étalon interne (IS). Une purification est effectuée soit par extraction en
phase solide (purification SPE, voir 6.3.1) à l’aide d’une cartouche C18, soit par extraction liquide-liquide
à l’aide de dichlorométhane (purification DCM, voir 6.3.2) lorsque les échantillons ne peuvent pas se
disperser dans l’eau. Les extraits sont analysés par CLHP-SM-SM (chromatographie en phase liquide à
haute performance couplée à une détection spectrométrique de masse).
L’identification de NDELA est obtenue à l’aide de l’ion moléculaire et de deux ions qualifiants. La
quantification de NDELA est réalisée par comparaison du ratio obtenu entre les ions fragments
majoritaires de la NDELA et du d8-NDELA avec une courbe d’étalonnage.
Conformément à l’ISO 12787, l’absence de NDELA dans l’échantillon pourrait être confirmée par une
seconde analyse. Une préparation dopée à une valeur cible pourrait être effectuée pour évaluer la limite
de détection de la NDELA dans l’échantillon.
Si un effet matrice est observé avec un impact significatif sur la performance de la méthode (sensibilité,
exactitude, etc.) pour un produit cosmétique spécifique, il est possible d’utiliser une procédure
d’étalonnage par ajouts dosés (se référer à l’ISO 12787).
4 Réactifs
Sauf indication contraire, n’utiliser, au cours de l’analyse, que des réactifs de qualité analytique reconnue
et de l’eau distillée ou de l’eau de qualité 1, conformément à l’ISO 3696:1987. Les solvants doivent être de
qualité pour analyse CLHP-SM.
4.1 Méthanol (MeOH), qualité CLHP-SM.
4.2 Éthanol (EtOH), qualité CLHP-SM.
4.3 Dichlorométhane (DCM), qualité CLHP-SM.
4.4 N-nitrosodiéthanolamine, de pureté connue, supérieure à 95 %.
4.5 d8-N-nitrosodiéthanolamine, de pureté connue, supérieure à 95 %.
4.6 Acétate d’ammonium (NH Ac), qualité analytique (adapté à l’analyse par CLHP-SM).
4.7 Solution d’acétate d’ammonium 1 mol/l, pour la préparation de 1,0 l, dissoudre 77,08 g de NH Ac
dans 1,0 l d’eau.
4.8 Éluant A: 2 mmol de NH Ac dans l’eau, pour la préparation de 1,0 l, à partir de 2 ml de NH Ac à
4 4
1 mol/l (4.7), complété à 1 l avec de l’eau.
4.9 Éluant B: 2 mmol de NH Ac dans 90/10 MeOH/eau (v/v), réalisé, pour la préparation de 1,0 l, à
partir de 2 ml de NH Ac à 1 mol/l (4.7), complété à 1 l avec un mélange de 90/10 de MeOH/eau (v/v).
5 Appareillage
Utiliser une verrerie et un équipement de laboratoire courant, ainsi
...