ISO 19337:2023
(Main)Nanotechnologies — Characteristics of working suspensions of nano-objects for in vitro assays to evaluate inherent nano-object toxicity
Nanotechnologies — Characteristics of working suspensions of nano-objects for in vitro assays to evaluate inherent nano-object toxicity
This document describes the characteristics of working suspensions of nano-objects to be considered when conducting in vitro assays to evaluate inherent nano-object toxicity. In addition, the document identifies applicable measurement methods for these characteristics. This document is applicable to nano-objects, and their aggregates and agglomerates greater than 100 nm. This document intends to help clarify whether observed toxic effects come from tested nano-objects themselves or from uncontrolled sources.
Nanotechnologies — Caractéristiques des suspensions de nano-objets utilisées pour les essais in vitro évaluant la toxicité inhérente aux nano-objets
Le présent document décrit les caractéristiques des suspensions de nano‑objets à prendre en considération pour les essais in vitro évaluant la toxicité inhérente aux nano‑objets. En outre, il identifie les méthodes de mesure applicables à ces caractéristiques. Le présent document est applicable aux nano‑objets, ainsi qu’à leurs agrégats et agglomérats d’une taille supérieure à 100 nm. Le présent document a pour objectif de clarifier si les effets toxiques observés proviennent des nano‑objets soumis à essai ou de sources non contrôlées.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19337
Second edition
2023-05
Nanotechnologies — Characteristics of
working suspensions of nano-objects
for in vitro assays to evaluate inherent
nano-object toxicity
Nanotechnologies — Caractéristiques des suspensions de nano-objets
utilisées pour les tests in vitro évaluant la toxicité inhérente aux nano-
objets
Reference number
© ISO 2023
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Abbreviated terms . 2
5 Characteristics and measurement methods . 2
5.1 General . 2
5.2 Stability of working suspensions . 3
5.2.1 General . 3
5.2.2 Representative size change of secondary particles of nano-objects . 3
5.2.3 Concentration change of nano-objects . 3
5.3 Concentration of metal ions . 3
5.4 Concentration of culture medium components . 4
5.4.1 General . 4
5.4.2 Proteins . 4
5.4.3 Calcium. 4
5.5 Contamination . 4
6 Reporting . 5
6.1 General . 5
6.2 Name of nano-objects and manufacturing information . 5
6.3 Composition and metallic elements included in the nano-object sample . 5
6.4 Culture medium and serum . 5
6.5 Measurement results . 5
6.6 Optional methods . 6
Annex A (normative) Flow of measurements .7
Annex B (informative) Measurement and evaluation of stability . 8
Annex C (informative) Measurement of metal ions . 9
Annex D (informative) Measurement of culture medium components .11
Annex E (informative) Contamination .12
Bibliography .13
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use
of (a) patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed
patent rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received
notice of (a) patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are
cautioned that this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent
database available at www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all
such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 229, Nanotechnologies.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TS 19337:2016) which has been
technically revised.
The main changes are as follows:
— “the flow of measurements” has been improved as shown in Figure A.1;
— the status of Annex A has been changed from informative to normative;
— “5.2 Endotoxin” has been replaced by “5.5 Contamination”.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Before nano-objects enter onto the market, their possible impact on human health and the environment
should be carefully evaluated.
In vitro toxicity assays using cultured cells are frequently used as a tool in screening materials for
possible hazardous properties. The testing provides essential information for understanding the
mechanisms of biological effects induced by the materials. However, nano-objects require specific
considerations with respect to the in vitro toxicity assays, because of their unique behaviour in cell
culture medium. For example, immediately after the introduction of nano-object samples into the
culture medium, the nano-objects can undergo changes in
a) ionic dissolution,
b) corona formation, or
c) aggregation/agglomeration
leading to alteration in particles size and sedimentation. Therefore, it is critical to consider the above-
mentioned phenomena in clarifying if the observed effects are related to the tested nano-object itself
or from uncontrolled sources and to avoid false interpretation of assay results. For example, the corona
formation, metal ion release from the nano-objects and impurities (residual from the nano-object
[1]
synthesis process) can interfere with some in vitro assays , producing inaccurate results. Additionally,
the formation of agglomerates and aggregates can alter the toxicity of a suspension. It is important to
carefully assess and describe the characteristics of the suspension of nano-objects being tested.
Therefore, the rigorous characterization of the working suspension prior and during in vitro toxicity
assays on these characteristics is essential to exclude the in vitro experimental artefacts. In this
document, the essential characteristics related to these three phenomena and applicable measurement
methods were summarized. On the other hands, this document does not include a strategy to select the
appropriate techniques from the applicable measurement methods because the working suspensions
that contain nano-object samples for in vitro toxicity assays has the different materials components,
concentration and sizes; thus, the appropriate selection is depending on the investigators. While
the related informative annexes and the list of references in the Bibliography are included in this
document to assist with appropriate method selection by investigators to make allowance for the
characterization method selection, optional methods are also given in this document. In Clause 6, the
details of the characterization methods/procedures are described; therefore, the appropriateness of
the characterization can be judged.
The intention of this document is for reliable test results on nano-object toxicity to be shared and
communicated among stakeholders of nano-objects, such as regulators, general public, manufacturers
and end users.
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 19337:2023(E)
Nanotechnologies — Characteristics of working
suspensions of nano-objects for in vitro assays to evaluate
inherent nano-object toxicity
1 Scope
This document describes the characteristics of working suspensions of nano-objects to be considered
when conducting in vitro assays to evaluate inherent nano-object toxicity. In addition, the document
identifies applicable measurement methods for these characteristics.
This document is applicable to nano-objects, and their aggregates and agglomerates greater than
100 nm.
This document intends to help clarify whether observed toxic effects come from tested nano-objects
themselves or from uncontrolled sources.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO/TS 80004-2, Nanotechnologies — Vocabulary — Part 2: Nano-objects
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/TS 80004-2 and the following
apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
culture medium
aqueous solution of nutrients required for cell growth
3.2
secondary particle
agglomerate/aggregate of primary particle(s), proteins and other medium components
3.3
stability
properties to remain unchanged over a given time under stated or reasonably expected conditions of
storage and use for an in vitro toxicity assay
3.4
working suspension
suspension prepared for an in vitro assay that includes culture medium (3.1) and nano-object sample
3.5
contamination
trace amounts of extrinsic substances present in the nano-object samples that affect cellular growth
4 Abbreviated terms
AAS atomic absorption spectrometry
BCA bicinchoninate acid
BSA Bovine serum albumin
C-U/F ultrafiltration assisted by centrifugation
DLS dynamic light scattering
AF4 asymmetrical-flow field-flow fractionation
ICP-AES inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometry
LAL limulus amebocyte lysate
LD laser diffraction
LPS liposaccharides
MAT monocyte activation test
PCR polymerase chain reaction
ppt parts per trillion
SLS static light scattering
TFF tangential flow filtration
TOC total organic carbon
U/F ultrafiltration
UV-Vis ultraviolet-visible
5 Characteristics and measurement methods
5.1 General
To characterize the working suspension for in vitro toxicity assays, it is necessary to identify certain
characteristics that can impact the biological system tested. Working suspensions for individual dose
shall be divided into two samples, one for toxicity assay and another for characteristics measurements.
Clause 5 specifies essential characteristics of the working suspension, listed below, and measurement
methods that are applicable to them:
— stability of working suspensions;
— concentration of metal ions;
— concentration of culture medium components;
— contamination.
Measurements of those characteristics shall be made for each dose of working suspensions. The flow of
measurements shall be in accordance with Annex A and Figure A.1.
5.2 Stability of working suspensions
5.2.1 General
Stability of working suspension is a key characteristic as it directly impacts the in vitro assay
[2],[3],[4]
conditions in terms of the dose of the nano-objects to the cells . Aggregation/agglomeration and
gravitational settling of the nano-objects are major issues that can affect the stability of the suspended
nano-objects. The suspension stability shall be evaluated for the two characteristics, i.e. the relative
change of representative size of secondary particles of nano-objects and the relative change of the
concentration of nano-objects in the working suspension. The change in size of secondary particles of
nano-objects can result from agglomeration of smaller particles in culture media. The relative change
of nano-object concentration can result from gravitational settling during an in vitro toxicity assay by
considering experimental duration required for the in vitro toxicity assay. Evaluation results of the
stability shall be expressed in the unit of per cent over the timescale for an in vitro toxicity assay.
[5]
ISO/TR 13097 is recommended as comprehensive guidance for stability of working suspension.
5.2.2 Representative size change of secondary particles of nano-objects
An appropriate method shall be selected to directly measure the representative size change of
[3],[6] [7] [8]
secondary particles of nano-objects from among DLS , LD and SLS . Other methods not listed in
this document can be used and reported according to the optional methods in 6.6.
See Annex B for measurements.
5.2.3 Concentration change of nano-objects
An appropriate method shall be selected to measure the concentration change of nano-objects
[3],[6],[8] [9],[10],[11]
suspended in the biological media from among the static light scattering , ICP-MS , UV-
[12] [13]
Vis absorption, X-ray transmission and the total organic carbon analysis . Other methods not
listed in this document can be used and reported according to the optional methods in 6.6.
See Annex B for measurements.
5.3 Concentration of metal ions
Metal ions, produced as a result of nano-object test sample dissolution, can contribute to observed cell
toxicity. The concentration of metal ions in the working suspension shall be measured after separation
of particulate matter. Particulate matter can be separated from the ionic fraction by U/F, C-U/F TFF or
centrifugation. The measurement shall be made for all metallic elements that are included in the nano-
object sample. An appropriate method shall be selected to measure the metal ion concentrations from
among ICP-AES, ICP-MS, AAS and the colorimetric method. It shall be noted that many constituents in
culture media such as Na and Cl can interfere with metals analysis for some spectrometry techniques,
[14]-[16]
especially ICP-MS . Other methods not listed in this document can be used and reported according
to the optional methods in 6.6. Measurement results of concentrations shall be expressed in the unit
of molarity, mass/mass or mass/volume. The measurements can be omitted when a toxic effect is not
observed to the cells in the working suspensions. See Annex A for an example of flow of measurements.
See Annex C for measurements.
5.4 Concentration of culture medium components
5.4.1 General
A nano-object sample added to a culture medium to generate a working suspension can adsorb
[1]
components of the culture medium . This adsorption can result in starvation stress to the test cells.
The concentration of protein components and calcium, as surrogates for the nutritional components
in the solvent shall be measured after allowing enough time after the addition of nano-object sample
to the culture medium. If culture medium components other than protein and calcium that can
significantly affect the stability of the working suspension for in vitro toxicity assays are known, the
concentration of those components shall be measured as well. The measurements can be omitted when
a toxic effect is not observed to the cells in the working suspensions. See Annex A for an example of flow
of measurements.
Nano-object sample in culture medium shall be incubated with the same conditions of in vitro test.
Nano-objects can affect pH, osmolality and other essential characteristics in the culture medium.
5.4.2 Proteins
An appropriate method shall be chosen for the protein concentration measurement from among BCA,
[17],[18]
Bradford, Lowry, and ultraviolet, refractive index and SLS methods coupled with the AF4 . When
[19] [20] [21]
BCA , Bradford or Lowry method are chosen, the protein concentration in the solvent shall
be measured after separation of particulate matter from the working suspension. Results of protein
concentration measurement shall be expressed in the unit of mass/volume.
See Annex D for measurements.
5.4.3 Calcium
An appropriate me
...
Norme
internationale
ISO 19337
Première édition
Nanotechnologies —
2023-05
Caractéristiques des suspensions
de nano-objets utilisées pour les
essais in vitro évaluant la toxicité
inhérente aux nano-objets
Nanotechnologies — Characteristics of working suspensions of
nano-objects for in vitro assays to evaluate inherent nano-object
toxicity
Numéro de référence
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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CH-1214 Vernier, Genève
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E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Abréviations . 2
5 Caractéristiques et méthodes de mesure . 2
5.1 Généralités .2
5.2 Stabilité des suspensions de travail .3
5.2.1 Généralités .3
5.2.2 Changement de taille représentatif des particules secondaires des nano-objets .3
5.2.3 Variation de la concentration des nano-objets .3
5.3 Concentration en ions métalliques .3
5.4 Concentration des composants du milieu de culture .4
5.4.1 Généralités .4
5.4.2 Protéines . . .4
5.4.3 Calcium.4
5.5 Contamination .4
6 Consignation dans un rapport . 5
6.1 Généralités .5
6.2 Nom des nano-objets et informations de fabrication .5
6.3 Composition et éléments métalliques inclus dans l’échantillon de nano-objet .5
6.4 Milieu de culture et sérum .5
6.5 Résultats des mesures .5
6.6 Méthodes facultatives .6
Annexe A (normative) Flux de mesures . 7
Annexe B (informative) Mesurage et évaluation de la stabilité . 8
Annexe C (informative) Mesurage des ions métalliques . 9
Annexe D (informative) Mesurage des composants du milieu de culture .11
Annexe E (informative) Contamination .12
Bibliographie .13
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de tout
droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas reçu
notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois, il y a lieu
d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations plus récentes
sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/brevets.
L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 229, Nanotechnologies.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO/TS 19337:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes :
— le « flux de mesures » a été amélioré comme indiqué à la Figure A.1 ;
— le statut de l’Annexe A a été modifié d’informative en normative ;
— « 5.2 Endotoxine » a été remplacé par « 5.5 Contamination ».
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Il convient d’évaluer soigneusement l’impact possible des nano-objets sur la santé humaine et sur
l’environnement avant qu’ils ne soient mis sur le marché.
Les essais de toxicité in vitro utilisant des cellules cultivées sont fréquemment utilisés comme un outil
d’analyse des matériaux afin de rechercher des propriétés éventuellement dangereuses. Les essais
fournissent des informations essentielles quant à la compréhension des mécanismes des effets biologiques
causés par les matériaux. Cependant, les nano‑objets nécessitent des considérations spécifiques en ce qui
concerne les essais de toxicité in vitro, en raison de leur comportement particulier dans un milieu de culture
cellulaire. Par exemple, immédiatement après l’introduction des échantillons de nano-objets dans le milieu
de culture, les nano‑objets peuvent subir des modifications telles que :
a) une dissolution ionique ;
b) la formation d’une couronne ;
c) une agrégation/agglomération ;
menant à une altération de la taille des particules et à la sédimentation. Par conséquent, il est essentiel de
tenir compte des phénomènes susmentionnés afin de déterminer si les effets observés sont liés au nano‑objet
soumis à essai ou à d’autres sources non contrôlées et afin d’éviter une interprétation erronée des résultats
de l’essai. Par exemple, la formation d’une couronne, ainsi que la libération d’ions métalliques et d’impuretés
(résiduelles issues du processus de synthèse du nano-objet) peuvent interférer avec certains essais in
[1]
vitro et fournir des résultats erronés. En outre, la formation d’agglomérats et d’agrégats peut modifier la
toxicité d’une suspension. Il est important d’évaluer soigneusement et de décrire les caractéristiques de la
suspension des nano-objets soumis à essai.
Par conséquent, la caractérisation rigoureuse de la suspension de travail avant et pendant les essais
de toxicité in vitro en ce qui concerne ces caractéristiques est essentielle afin d’exclure les artéfacts
expérimentaux in vitro. Le présent document récapitule les caractéristiques essentielles liées à ces trois
phénomènes ainsi que les méthodes de mesure applicables. D’autre part, le présent document ne fournit
pas de stratégie permettant de sélectionner les techniques appropriées parmi les méthodes de mesure
applicables, car les suspensions de travail contiennent des échantillons de nano-objets destinés aux essais de
toxicité in vitro qui présentent différents matériaux, composants, concentrations et tailles. Par conséquent,
les chercheurs sont chargés de sélectionner la méthode appropriée. Bien que les annexes informatives et la
liste de références de la bibliographie soient incluses au présent document afin d’aider les chercheurs à choisir
la méthode appropriée, des méthodes facultatives sont également indiquées dans le présent document afin
de tenir compte de la sélection de la méthode de caractérisation. L’Article 6 décrit les détails des méthodes/
modes opératoires de caractérisation, ce qui permet de juger de la pertinence de la caractérisation.
L’objectif du présent document est de partager et de transmettre des résultats d’essai fiables sur la toxicité
des nano-objets entre les parties prenantes intéressées par les nano-objets, telles que les autorités de
réglementation, le public général, les fabricants et les utilisateurs finaux.
v
Norme internationale ISO 19337:2023(fr)
Nanotechnologies — Caractéristiques des suspensions de
nano-objets utilisées pour les essais in vitro évaluant la
toxicité inhérente aux nano-objets
1 Domaine d’application
Le présent document décrit les caractéristiques des suspensions de nano-objets à prendre en considération
pour les essais in vitro évaluant la toxicité inhérente aux nano‑objets. En outre, il identifie les méthodes de
mesure applicables à ces caractéristiques.
Le présent document est applicable aux nano-objets, ainsi qu’à leurs agrégats et agglomérats d’une taille
supérieure à 100 nm.
Le présent document a pour objectif de clarifier si les effets toxiques observés proviennent des nano‑objets
soumis à essai ou de sources non contrôlées.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO/TS 80004-2, Nanotechnologies — Vocabulaire — Partie 2 : Nano-objets
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO/TS 80004‑2 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
milieu de culture
solution aqueuse de nutriments nécessaires à la croissance cellulaire
3.2
particule secondaire
agglomérat/agrégat de particules primaires, de protéines et d’autres composants du milieu
3.3
stabilité
propriétés restant inchangées sur une période donnée dans des conditions de stockage et d’utilisation
définies ou raisonnablement prévisibles pour un essai de toxicité in vitro
3.4
suspension de travail
suspension préparée pour un essai in vitro comprenant un milieu de culture (3.1) et un échantillon de
nano-objet
3.5
contamination
traces de substances extrinsèques présentes dans les échantillons de nano‑objets qui exercent une influence
sur la croissance cellulaire
4 Abréviations
AAS spectrométrie d’absorption atomique (atomic absorption spectrometry)
BCA acide bicinchoninate (bicinchoninate acid)
ASB albumine de sérum de bovin
C-U/F ultrafiltration assistée par centrifugation
DLS diffusion dynamique de la lumière (dynamic light scattering)
AF4 fractionnement par couplage flux‑force asymétrique
ICP-AES spectroscopie d’émission atomique à plasma à couplage inductif (inductively coupled plasma-ato-
mic emission spectrometry)
ICP-MS spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (inductively coupled plasma mass spec-
trometry)
LAL lysat d’amébocytes de limule
LD diffraction laser (laser diffraction)
LPS liposaccharides
MAT essai d’activation de monocytes (monocyte activation test)
PCR réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction)
ppt parties par billion (parts per trillion)
SLS diffusion statique de la lumière (static light scattering)
TFF filtration tangentielle (tangential flow filtration)
COT carbone organique total
U/F ultrafiltration
UV-Vis ultraviolet-visible
5 Caractéristiques et méthodes de mesure
5.1 Généralités
Afin de caractériser la suspension de travail pour les essais de toxicité in vitro, il est nécessaire d’identifier
certaines caractéristiques qui peuvent avoir un impact sur le système biologique soumis à essai. Les
suspensions de travail pour la dose individuelle doivent être divisées en deux échantillons, l’un pour l’essai de
toxicité et l’autre pour les mesures des caractéristiques. L’Article 5 spécifie les caractéristiques essentielles
de la suspension de travail, énumérées ci-dessous, et les méthodes de mesure qui leur sont applicables :
— la stabilité des suspensions de travail ;
— la concentration des ions métalliques ;
— la concentration des composants du milieu de culture ;
— la contamination.
Des mesures de ces caractéristiques doivent être effectuées pour chaque dose de suspension de travail. Le
flux de mesures doit être conforme à l’Annexe A et à la Figure A.1.
5.2 Stabilité des suspensions de travail
5.2.1 Généralités
La stabilité de la suspension de travail est une caractéristique clé car elle a un impact direct sur les
[2],[3], [4]
conditions d’essai in vitro en matière de dose des nano-objets dans les cellules . L’agrégation/
agglomération et la sédimentation gravitationnelle des nano-objets sont des problèmes majeurs qui peuvent
influencer la stabilité des nano‑objets en suspension. La stabilité de la suspension doit être évaluée pour les
deux caractéristiques, c’est-à-dire la variation relative de la taille représentative des particules secondaires
des nano-objets et la variation relative de la concentration des nano-objets dans la suspension de travail.
Le changement de taille des particules secondaires des nano-objets peut résulter de l’agglomération de
particules plus petites dans les milieux de culture. La variation relative de la concentration des nano-objets
peut résulter de la sédimentation gravitationnelle au cours d’un essai de toxicité in vitro, en tenant compte
de la durée expérimentale requise pour ledit essai. Les résultats de l’évaluation de la stabilité doivent être
exprimés en pourcentage sur l’échelle de temps d’un essai de toxicité in vitro.
[5]
L’ISO/TR 13097 est recommandé en tant que guide complet pour la stabilité de la suspension de travail.
5.2.2 Changement de taille représentatif des particules secondaires des nano-objets
Une méthode appropriée doit être sélectionnée pour mesurer directement la variation de taille représentative
[3], [6] [7] [8]
des particules secondaires des nano-objets parmi les DLS , LD et SLS. D’autres méthodes non
répertoriées dans le présent document peuvent être utilisées et consignées conformément aux méthodes
facultatives en 6.6.
Voir l’Annexe B pour des mesures.
5.2.3 Variation de la concentration des nano-objets
Une méthode appropriée doit être sélectionnée pour mesurer la variation de concentration des nano-objets
[3],[6], [8] [9],[10], [11]
en suspension dans le milieu biologique parmi la diffusion statique de la lumière , l’ICP-MS ,
[12] [13]
l’absorption UV-Vis, la transmission des rayons X et l’analyse du carbone organique total. D’autres
méthodes non répertoriées dans le présent document peuvent être utilisées et consignées conformément
aux méthodes facultatives en 6.6.
Voir l’Annexe B pour des mesures.
5.3 Concentration en ions métalliques
Les ions métalliques, produits lors de la mise en solution de l’échantillon pour essai de nano-objet, peuvent
contribuer à la toxicité cellulaire observée. La concentration en ions métalliques dans la suspension de travail
doit être mesurée après séparation des matières particulaires. La matière particulaire peut être séparée de
la fraction ionique par U/F, C-U/F, TFF ou centrifugation. La mesure doit être effectuée pour tous les éléments
métalliques inclus dans l’échantillon de nano-objet. Une méthode appropriée doit être choisie pour mesurer
les concentrations en ions métalliques parmi l’ICP-AES, l’ICP-MS, l’AAS et la méthode colorimétrique. Il faut
noter que de nombreux constituants des milieux de culture tels que Na et Cl peuvent interférer avec l’analyse
[14]- [16]
des métaux pour certaines techniques de spectrométrie, en particulier l’ICP-MS . D’autres méthodes
non répertoriées dans le présent document peuvent être utilisées et consignées conformément aux méthodes
facultatives en 6.6. Les résultats de mesure des concentrations doivent être exprimés en unités de molarité,
masse/masse ou masse/volume. Les mesures peuvent être omises lorsqu’aucun effet toxique n’est observé
sur les cellules des suspensions de travail. Voir l’Annexe A pour un exemple de flux de mesures.
Voir l’Annexe C pour des mesures.
5.4 Concentration des composants du milieu de culture
5.4.1 Généralités
Un échantillon de nano‑objets ajouté à un milieu de culture afin de créer une suspension de travail peut
[1]
adsorber les composants du milieu de culture. Cette adsorption peut entraîner un stress de privation pour
les cellules d’essai. La concentration en composants protéiques et en calcium, en tant que substituts des
composants nutritionnels dans le solvant, doit être mesurée après avoir laissé suffisamment de temps après
l’ajout de l’échantillon de nano-objet au milieu de culture. Si des composants du milieu de culture autres que
les protéines et le calcium susceptibles d’influencer de manière significative la stabilité de la suspension de
travail pour les essais de toxicité in vitro sont connus, la concentration de ces composants doit également
être mesurée. Les mesures peuvent être omises lorsqu’aucun effet toxique n’est observé sur les cellules des
suspensions de travail. Voir l’Annexe A pour un exemple de flux de mesures.
L’échantillon de nano-objet dans le milieu de culture doit être incubé dans les mêmes conditions que celles de
l’essai in vitro. Les nano‑objets peuvent influencer le pH, l’osmolalité et d’autres caractéristiques essentielles
du milieu de culture.
5.4.2 Protéines
Une méthode appropriée doit être choisie pour la mesure de la concentration en protéines parmi les
[17], [18]
méthodes BCA, Bradford, Lowry, UV, indice de réfraction et SLS couplées à l’AF4 . Si la méthode
[19] [20] [21]
BCA, Bradford ou Lowry est choisie, la concentration en
...
ISO/TC 229/SC 2
Date : 2024-09-04
ISO 19337:2023(Ffr)
ISO/TC 146/SC 2/GT 10
Secrétariat : ANSI
Première édition
2023-05
Nanotechnologies — Caractéristiques des suspensions de nano--
objets utilisées pour les essais in vitro évaluant la toxicité
inhérente aux nano--objets
Nanotechnologies — Characteristics of working suspensions of nano--objects for in vitro assays to
evaluate inherent nano--object toxicity
ICS : 07.120
Type du document : Norme internationale
Sous-type du document :
Stade du document : (60) Publication
Langue du document : F
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
Type du document : Norme internationale
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Stade du document : (60) Publication
Langue du document : F
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de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
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demandeur.
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E--mail : copyright@iso.org
Web : www.iso.org
Website: www.iso.org
Publié en Suisse
iii
Sommaire Page
Avant‑propos . vi
Introduction . vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Abréviations . 2
5 Caractéristiques et méthodes de mesure . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Stabilité des suspensions de travail . 3
5.3 Concentration en ions métalliques . 4
5.4 Concentration des composants du milieu de culture . 4
5.5 Contamination . 5
6 Consignation dans un rapport . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Nom des nano‑objets et informations de fabrication . 5
6.3 Composition et éléments métalliques inclus dans l’échantillon de nano‑objet . 5
6.4 Milieu de culture et sérum . 6
6.5 Résultats des mesures . 6
6.6 Méthodes facultatives . 7
Annexe A (normative) Flux de mesures . 8
Annexe B (informative) Mesurage et évaluation de la stabilité . 10
Annexe C (informative) Mesurage des ions métalliques . 11
Annexe D (informative) Mesurage des composants du milieu de culture . 13
Annexe E (informative) Contamination . 14
Bibliographie . 15
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Abréviations . 2
5 Caractéristiques et méthodes de mesure . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Stabilité des suspensions de travail . 3
5.2.1 Généralités . 3
5.2.2 Changement de taille représentatif des particules secondaires des nano-objets . 3
5.2.3 Variation de la concentration des nano-objets . 4
5.3 Concentration en ions métalliques . 4
iv © ISO 2023 – Tous droits réservés
iv
5.4 Concentration des composants du milieu de culture . 4
5.4.1 Généralités . 4
5.4.2 Protéines . 5
5.4.3 Calcium . 5
5.5 Contamination . 5
6 Consignation dans un rapport . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Nom des nano-objets et informations de fabrication . 5
6.3 Composition et éléments métalliques inclus dans l’échantillon de nano-objet . 5
6.4 Milieu de culture et sérum . 6
6.5 Résultats des mesures . 6
6.6 Méthodes facultatives . 7
Annexe A (normative) Flux de mesures . 8
Annexe B (informative) Mesurage et évaluation de la stabilité . 9
Annexe C (informative) Mesurage des ions métalliques . 10
Annexe D (informative) Mesurage des composants du milieu de culture. 12
Annexe E (informative) Contamination . 13
Bibliographie . 14
v
Avant-‑propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont décrites
dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents critères
d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été rédigé
conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois, il
y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations plus
récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets.www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions spécifiques
de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux
principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce
(OTC), voir www.iso.org/avant-proposwww.iso.org/avant‑propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 229, Nanotechnologies.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO/TS 19337:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes :
— — le « flux de mesures » a été amélioré comme indiqué à la Figure A.1Figure A.1 ;
— — le statut de l’Annexe Al’Annexe A a été modifié d’informative en normative ;
— — « 5.2« 5.2 Endotoxine » a été remplacé par « 5.55.5 Contamination ».
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.htmlwww.iso.org/fr/members.html.
vi © ISO 2023 – Tous droits réservés
vi
Introduction
Il convient d’évaluer soigneusement l’impact possible des nano-‑objets sur la santé humaine et sur
l’environnement avant qu’ils ne soient mis sur le marché.
Les essais de toxicité in vitro utilisant des cellules cultivées sont fréquemment utilisés comme un outil
d’analyse des matériaux afin de rechercher des propriétés éventuellement dangereuses. Les essais fournissent
des informations essentielles quant à la compréhension des mécanismes des effets biologiques causés par les
matériaux. Cependant, les nano-‑objets nécessitent des considérations spécifiques en ce qui concerne les
essais de toxicité in vitro, en raison de leur comportement particulier dans un milieu de culture cellulaire. Par
exemple, immédiatement après l’introduction des échantillons de nano-‑objets dans le milieu de culture, les
nano-‑objets peuvent subir des modifications telles que :
a) a) une dissolution ionique ;
b) b) la formation d’une couronne ;
c) c) une agrégation/agglomération ;
menant à une altération de la taille des particules et à la sédimentation. Par conséquent, il est essentiel de tenir
compte des phénomènes susmentionnés afin de déterminer si les effets observés sont liés au nano-‑objet
soumis à essai ou à d’autres sources non contrôlées et afin d’éviter une interprétation erronée des résultats
de l’essai. Par exemple, la formation d’une couronne, ainsi que la libération d’ions métalliques et d’impuretés
(résiduelles issues du processus de synthèse du nano-‑objet) peuvent interférer avec certains essais in
[1][1]
vitro et fournir des résultats erronés. En outre, la formation d’agglomérats et d’agrégats peut modifier la
toxicité d’une suspension. Il est important d’évaluer soigneusement et de décrire les caractéristiques de la
suspension des nano-‑objets soumis à essai.
Par conséquent, la caractérisation rigoureuse de la suspension de travail avant et pendant les essais de toxicité
in vitro en ce qui concerne ces caractéristiques est essentielle afin d’exclure les artéfacts expérimentaux in
vitro. Le présent document récapitule les caractéristiques essentielles liées à ces trois phénomènes ainsi que
les méthodes de mesure applicables. D’autre part, le présent document ne fournit pas de stratégie permettant
de sélectionner les techniques appropriées parmi les méthodes de mesure applicables, car les suspensions de
travail contiennent des échantillons de nano-‑objets destinés aux essais de toxicité in vitro qui présentent
différents matériaux, composants, concentrations et tailles. Par conséquent, les chercheurs sont chargés de
sélectionner la méthode appropriée. Bien que les annexes informatives et la liste de références de la
bibliographie soient incluses au présent document afin d’aider les chercheurs à choisir la méthode appropriée,
des méthodes facultatives sont également indiquées dans le présent document afin de tenir compte de la
sélection de la méthode de caractérisation. L’Article 6L’Article 6 décrit les détails des méthodes/modes
opératoires de caractérisation, ce qui permet de juger de la pertinence de la caractérisation.
L’objectif du présent document est de partager et de transmettre des résultats d’essai fiables sur la toxicité
des nano-‑objets entre les parties prenantes intéressées par les nano-‑objets, telles que les autorités de
réglementation, le public général, les fabricants et les utilisateurs finaux.
vii
NORME INTERNATIONALE ISO 19337:2023(F)
Nanotechnologies — Caractéristiques des suspensions de nano--
objets utilisées pour les essais in vitro évaluant la toxicité inhérente
aux nano--objets
1 Domaine d’application
Le présent document décrit les caractéristiques des suspensions de nano-‑objets à prendre en considération
pour les essais in vitro évaluant la toxicité inhérente aux nano-‑objets. En outre, il identifie les méthodes de
mesure applicables à ces caractéristiques.
Le présent document est applicable aux nano-‑objets, ainsi qu’à leurs agrégats et agglomérats d’une taille
supérieure à 100 nm.
Le présent document a pour objectif de clarifier si les effets toxiques observés proviennent des nano-‑objets
soumis à essai ou de sources non contrôlées.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur contenu,
des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO/TS 80004--2, Nanotechnologies — Vocabulaire — Partie 2 : Nano-‑objets
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO/TS 80004--2 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes :
— — ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse
https://www.iso.org/obphttps://www.iso.org/obp
— — IEC Electropedia : disponible à l’adresse
https://www.electropedia.org/https://www.electropedia.org/
3.1
milieu de culture
solution aqueuse de nutriments nécessaires à la croissance cellulaire
3.2
particule secondaire
agglomérat/agrégat de particules primaires, de protéines et d’autres composants du milieu
3.3
stabilité
propriétés restant inchangées sur une période donnée dans des conditions de stockage et d’utilisation définies
ou raisonnablement prévisibles pour un essai de toxicité in vitro
3.4
suspension de travail
suspension préparée pour un essai in vitro comprenant un milieu de culture (3.1)(3.1) et un échantillon de
nano-‑objet
3.5
contamination
traces de substances extrinsèques présentes dans les échantillons de nano-‑objets qui exercent une influence
sur la croissance cellulaire
4 Abréviations
AAS spectrométrie d’absorption atomique (atomic absorption spectrometry)
BCA acide bicinchoninate (bicinchoninate acid)
ASB albumine de sérum de bovin
C-‑U/F ultrafiltration assistée par centrifugation
DLS diffusion dynamique de la lumière (dynamic light scattering)
AF4 fractionnement par couplage flux-‑force asymétrique
ICP-‑AES spectroscopie d’émission atomique à plasma à couplage inductif (inductively coupled
plasma-‑atomic emission spectrometry)
ICP-‑MS spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (inductively coupled plasma mass
spectrometry)
LAL lysat d’amébocytes de limule
LD diffraction laser (laser diffraction)
LPS liposaccharides
MAT essai d’activation de monocytes (monocyte activation test)
PCR réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction)
ppt parties par billion (parts per trillion)
SLS diffusion statique de la lumière (static light scattering)
TFF filtration tangentielle (tangential flow filtration)
COT carbone organique total
U/F ultrafiltration
UV-‑Vis ultraviolet-‑visible
2 © ISO 2023 – Tous droits réservés
5 Caractéristiques et méthodes de mesure
5.1 Généralités
Afin de caractériser la suspension de travail pour les essais de toxicité in vitro, il est nécessaire d’identifier
certaines caractéristiques qui peuvent avoir un impact sur le système biologique soumis à essai. Les
suspensions de travail pour la dose individuelle doivent être divisées en deux échantillons, l’un pour l’essai de
toxicité et l’autre pour les mesures des caractéristiques. L’Article 5L’Article 5 spécifie les caractéristiques
essentielles de la suspension de travail, énumérées ci-‑dessous, et les méthodes de mesure qui leur sont
applicables :
— — la stabilité des suspensions de travail ;
— — la concentration des ions métalliques ;
— — la concentration des composants du milieu de culture ;
— — la contamination.
Des mesures de ces caractéristiques doivent être effectuées pour chaque dose de suspension de travail. Le flux
de mesures doit être conforme à l’Annexe A et à la Figure A.1.l’Annexe A et à la Figure A.1.
5.2 Stabilité des suspensions de travail
5.2.1 Généralités
La stabilité de la suspension de travail est une caractéristique clé car elle a un impact direct sur les conditions
[2],[3], [4][2],[3], [4]
d’essai in vitro en matière de dose des nano-‑objets dans les cellules . . L’agrégation/agglomération
et la sédimentation gravitationnelle des nano-‑objets sont des problèmes majeurs qui peuvent influencer la
stabilité des nano-‑objets en suspension. La stabilité de la suspension doit être évaluée pour les deux
caractéristiques, c’est-‑à-‑dire la variation relative de la taille représentative des particules secondaires des
nano-‑objets et la variation relative de la concentration des nano-‑objets dans la suspension de travail. Le
changement de taille des particules secondaires des nano-‑objets peut résulter de l’agglomération de
particules plus petites dans les milieux de culture. La variation relative de la concentration des nano-‑objets
peut résulter de la sédimentation gravitationnelle au cours d’un essai de toxicité in vitro, en tenant compte de
la durée expérimentale requise pour ledit essai. Les résultats de l’évaluation de la stabilité doivent être
exprimés en pourcentage sur l’échelle de temps d’un essai de toxicité in vitro.
[5][5]
L’ISO/TR 13097 est recommandé en tant que guide complet pour la stabilité de la suspension de travail.
5.2.2 Changement de taille représentatif des particules secondaires des nano-‑objets
Une méthode appropriée doit être sélectionnée pour mesurer directement la variation de taille représentative
[3], [6][3], [6] [7][7] [8] [8]
des particules secondaires des nano-‑objets parmi les DLS , , LD et SLS. . D’autres méthodes non
répertoriées dans le présent document peuvent être utilisées et consignées conformément aux méthodes
facultatives en 6.6.6.6.
Voir l’Annexe Bl’Annexe B pour des mesures.
5.2.3 Variation de la concentration des nano-‑objets
Une méthode appropriée doit être sélectionnée pour mesurer la variation de concentration des nano-‑objets
[3],[6], [8][3],[6], [8]
en suspension dans le milieu biologique parmi la diffusion statique de la lumière , ,
[9],[10], [11][9],[10], [11] [12][12]
l’ICP-‑MS , , l’absorption UV-‑Vis, la transmission des rayons X et l’analyse du carbone
[13] [13]
organique total. . D’autres méthodes non répertoriées dans le présent document peuvent être utilisées et
consignées conformément aux méthodes facultatives en 6.6.6.6.
Voir l’Annexe BVoir l’Annexe B pour des mesures.
5.3 Concentration en ions métalliques
Les ions métalliques, produits lors de la mise en solution de l’échantillon pour essai de nano-‑objet, peuvent
contribuer à la toxicité cellulaire observée. La concentration en ions métalliques dans la suspension de travail
doit être mesurée après séparation des matières particulaires. La matière particulaire peut être séparée de la
fraction ionique par U/F, C-‑U/F, TFF ou centrifugation. La mesure doit être effectuée pour tous les éléments
métalliques inclus dans l’échantillon de nano-‑objet. Une méthode appropriée doit être choisie pour mesurer
les concentrations en ions métalliques parmi l’ICP-‑AES, l’ICP-‑MS, l’AAS et la méthode colorimétrique. Il faut
noter que de nombreux constituants des milieux de culture tels que Na et Cl peuvent interférer avec l’analyse
[14]- [16] [14]‑ [16]
des métaux pour certaines techniques de spectrométrie, en particulier l’ICP-MS . ‑MS . D’autres
méthodes non répertoriées dans le présent document peuvent être utilisées et consignées conformément aux
méthodes facultatives en 6.6.6.6. Les résultats de mesure des concentrations doivent être exprimés en unités
de molarité, masse/masse ou masse/volume. Les mesures peuvent être omises lorsqu’aucun effet toxique
n’est observé sur les cellules des suspensions de travail. Voir l’Annexe AVoir l’Annexe A pour un exemple de
flux de mesures.
Voir l’Annexe CVoir l’Annexe C pour des mesures.
5.4 Concentration des composants du milieu de culture
5.4.1 Généralités
Un échantillon de nano-‑objets ajouté à un milieu de culture afin de créer une suspension de travail peut
[1] [1]
adsorber les composants du milieu de culture. . Cette adsorption peut entraîner un stress de privation pour
les cellules d’essai. La concentration en composants protéiques et en calcium, en tant que substituts des
composants nutritionnels dans le solvant, doit être mesurée après avoir laissé
...
Questions, Comments and Discussion
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