SIST ISO 9308-2:2013

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9308-2
Second edition
2012-07-01
Water quality — Enumeration of
Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des
organismes coliformes —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable

Reference number
©
ISO 2012
©  ISO 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56  CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved

Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1  Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 2
4  Principle . 2
5  Apparatus and glassware . 2
6  Culture media and reagents . 3
7  Sampling . 3
8  Procedure . 3
9  Expression of results . 4
10  Test report . 4
11  Quality assurance . 4
Annex A (informative) Further microbiological information on coliform bacteria . 5
5)
Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results . 6
Annex C (informative) Composition of the Colilert-18 medium . 42
8)
Annex D (informative) Validation of Colilert-18/Quanti-Tray for the enumeration of E.coli and
coliform bacteria from water . 44
Bibliography . 46

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
ISO 9308-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9308-2:1990), which has been technically
revised.
ISO 9308 consists of the following parts, under the general title Water quality — Enumeration of Escherichia
coli and coliform bacteria:
 Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
 Part 2: Most probable number method
 Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in
surface and waste water
iv © ISO 2012 – All rights reserved

Introduction
The presence and extent of faecal pollution is an important factor in assessing the quality of a body of water
and the risk to human health from infection. Examination of water samples for the presence of Escherichia coli
(E. coli), which normally inhabits the bowel of man and other warm-blooded animals, provides an indication of
such pollution. Examination for coliform bacteria can be more difficult to interpret because some coliform
bacteria live in soil and surface fresh water and are not always intestinal. Therefore, the presence of coliform
bacteria, although not a proof of faecal contamination, may indicate a failure in treatment or ingress of water
into the distribution system.
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of patents concerning Colilert-18 and Quanti-Tray and
Quanti-Tray 2000 given in this document.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.
The holder of this patent right has assured the ISO that he/she is willing to negotiate licences either free of
charge or under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout the world.
In this respect, the statement of the holder of this patent right is registered with ISO. Information may be
obtained from:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 USA
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
ISO (http://www.iso.org/patents) and IEC (http://patents.iec.ch) maintain on-line databases of patents relevant
to their standards. Users are encouraged to consult the databases for the most up to date information
concerning patents.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 9308-2:2012(E)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2:
Most probable number method
WARNING – Persons using this part of ISO 9308 should be familiar with normal laboratory practice.
This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated
with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and
to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT – It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of ISO 9308
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of E. coli and coliform bacteria in water. The
method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the “Most Probable
Number” (MPN) of organisms by reference to MPN tables. This method can be applied to all types of water,
including those containing an appreciable amount of suspended matter and high background counts of
heterotrophic bacteria. However, it must not be used for the enumeration of coliform bacteria in marine water.
When using for the enumeration of E. coli in marine waters, a 1→10 dilution in sterile water is typically
required, although the method has been shown to work well with some marine waters that have a lower than
normal concentration of salts. In the absence of data to support the use of the method without dilution, a
1→10 dilution is used.
This method relies upon the detection of E. coli based upon expression of the enzyme -D-glucuronidase and
consequently does not detect many of the enterohaemorhagic strains of E. coli, which do not typically express
this enzyme. Additionally, there are a small number of other E. coli strains that do not express
-D-glucuronidase.
The choice of tests used in the detection and confirmation of the coliform group of bacteria, including E. coli,
can be regarded as part of a continuous sequence. The extent of confirmation with a particular sample
depends partly on the nature of the water and partly on the reasons for the examination. The test described in
this part of ISO 9308 provides a confirmed result with no requirement for further confirmation of positive wells.
NOTE While this method describes the use of an enumeration device that is commercially available, the medium
described here can also be used in a standard MPN format.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions
For the purpose of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following apply.
3.1
coliform bacterium
member of the Enterobacteriaceae that express the enzyme -D-galactosidase
3.2
Escherichia coli
member of the Enterobacteriaceae that expresses both -D-galactosidase and -D-glucuronidase enzymes
4 Principle
A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml), or a dilution of a sample made up
to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to afford dissolution of the
1)
1)
medium. The sample plus medium is then aseptically poured into a Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000 to
enumerate up to 201 organisms or 2 419 organisms per 100 ml, respectively. Trays are sealed with a

1)
Quanti-Tray Sealer and then incubated at (36 ± 2) °C for 18 h to 22 h.
After incubation, sample wells that have a yellow colour of equal or greater intensity than that of the
comparator wells are considered positive for coliform bacteria. Yellow wells that also exhibit any degree of
fluorescence are considered positive for E. coli.
By means of statistical tables, or a simple computer program, the most probable number (MPN) of coliform
bacteria and E. coli in 100 ml of the sample can be determined.
NOTE The yellow colouration can be seen with the naked eye and results from the cleavage of ortho-nitrophenol
galactoside by the enzyme -D-galactosidase. The fluorescence is demonstrable under ultraviolet light (365 nm) and
originates from the cleavage of the molecule 4-methylumbelliferyl glucuronide (MUG) by the enzyme -D-glucuronidase to
produce the fluorescent compound methyl umbelliferone.
5 Apparatus and glassware
Use microbiological laboratory equipment and, in particular, the following:
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave)
Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in
ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat sterilization.
5.3 Incubator, thermostatically controlled at (36 ± 2) °C.
1)
5.4 Quanti-Tray sealer.
5.5 Sterile wide mouthed vessels of at least 110 ml.

1) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States
and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not
constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2012 – All rights reserved

2)
5.6 Quanti-Tray comparator.
5.7 Ultraviolet lamp, 365 nm.
2) 2)
/
5.8 Quanti-Tray or Quanti-Tray 2000 , see Annex B.
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials
3)
The method utilises Colilert -18 a medium based on the Defined Substrate Technology available for a 100 ml
sample as a ready to use powder dispensed in snap packs. Each snap pack contains sufficient medium
(2,8 g) for a single test. Medium is stored under ambient conditions (2 °C to 25 °C) out of direct sunlight and
should be used before the expiry date listed on the snap pack.
The medium is composed of two components to give the final concentrations as shown in Annex C.
6.2 Diluent
3)
For dilutions to be used with Colilert -18, use only sterile, non-inhibitory, oxidant-free water (deionized or tap).
The use of buffered, saline or peptone-containing diluents interferes with the performance of the test.
6.3 Antifoam B
Antifoam B is a 10 % active, water soluble suspension of silicone.
7 Sampling
Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Preparation of the sample
Samples should be transported and stored at (5  3) °C in accordance with ISO 19458 and analys
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9308-2
Second edition
2012-07-01
Water quality — Enumeration of
Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 2:
Most probable number method
Qualité de l'eau — Dénombrement des Escherichia coli et des
organismes coliformes —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable

Reference number
©
ISO 2012
©  ISO 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56  CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved

Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1  Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 2
4  Principle . 2
5  Apparatus and glassware . 2
6  Culture media and reagents . 3
7  Sampling . 3
8  Procedure . 3
9  Expression of results . 4
10  Test report . 4
11  Quality assurance . 4
Annex A (informative) Further microbiological information on coliform bacteria . 5
5)
Annex B (normative) The Quanti-Tray Sealer and calculation of results . 6
Annex C (informative) Composition of the Colilert-18 medium . 42
8)
Annex D (informative) Validation of Colilert-18/Quanti-Tray for the enumeration of E.coli and
coliform bacteria from water . 44
Bibliography . 46

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
ISO 9308-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9308-2:1990), which has been technically
revised.
ISO 9308 consists of the following parts, under the general title Water quality — Enumeration of Escherichia
coli and coliform bacteria:
 Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
 Part 2: Most probable number method
 Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in
surface and waste water
iv © ISO 2012 – All rights reserved

Introduction
The presence and extent of faecal pollution is an important factor in assessing the quality of a body of water
and the risk to human health from infection. Examination of water samples for the presence of Escherichia coli
(E. coli), which normally inhabits the bowel of man and other warm-blooded animals, provides an indication of
such pollution. Examination for coliform bacteria can be more difficult to interpret because some coliform
bacteria live in soil and surface fresh water and are not always intestinal. Therefore, the presence of coliform
bacteria, although not a proof of faecal contamination, may indicate a failure in treatment or ingress of water
into the distribution system.
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of patents concerning Colilert-18 and Quanti-Tray and
Quanti-Tray 2000 given in this document.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.
The holder of this patent right has assured the ISO that he/she is willing to negotiate licences either free of
charge or under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout the world.
In this respect, the statement of the holder of this patent right is registered with ISO. Information may be
obtained from:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 USA
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
ISO (http://www.iso.org/patents) and IEC (http://patents.iec.ch) maintain on-line databases of patents relevant
to their standards. Users are encouraged to consult the databases for the most up to date information
concerning patents.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 9308-2:2012(E)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2:
Most probable number method
WARNING – Persons using this part of ISO 9308 should be familiar with normal laboratory practice.
This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated
with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and
to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT – It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of ISO 9308
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of E. coli and coliform bacteria in water. The
method is based on the growth of target organisms in a liquid medium and calculation of the “Most Probable
Number” (MPN) of organisms by reference to MPN tables. This method can be applied to all types of water,
including those containing an appreciable amount of suspended matter and high background counts of
heterotrophic bacteria. However, it must not be used for the enumeration of coliform bacteria in marine water.
When using for the enumeration of E. coli in marine waters, a 1→10 dilution in sterile water is typically
required, although the method has been shown to work well with some marine waters that have a lower than
normal concentration of salts. In the absence of data to support the use of the method without dilution, a
1→10 dilution is used.
This method relies upon the detection of E. coli based upon expression of the enzyme -D-glucuronidase and
consequently does not detect many of the enterohaemorhagic strains of E. coli, which do not typically express
this enzyme. Additionally, there are a small number of other E. coli strains that do not express
-D-glucuronidase.
The choice of tests used in the detection and confirmation of the coliform group of bacteria, including E. coli,
can be regarded as part of a continuous sequence. The extent of confirmation with a particular sample
depends partly on the nature of the water and partly on the reasons for the examination. The test described in
this part of ISO 9308 provides a confirmed result with no requirement for further confirmation of positive wells.
NOTE While this method describes the use of an enumeration device that is commercially available, the medium
described here can also be used in a standard MPN format.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199, Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions
For the purpose of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the following apply.
3.1
coliform bacterium
member of the Enterobacteriaceae that express the enzyme -D-galactosidase
3.2
Escherichia coli
member of the Enterobacteriaceae that expresses both -D-galactosidase and -D-glucuronidase enzymes
4 Principle
A snap pack of dehydrated medium is added to a sample of water (100 ml), or a dilution of a sample made up
to 100 ml. Sample plus medium is gently shaken to ensure adequate mixing and to afford dissolution of the
1)
1)
medium. The sample plus medium is then aseptically poured into a Quanti-Tray or Quanti-Tray/2000 to
enumerate up to 201 organisms or 2 419 organisms per 100 ml, respectively. Trays are sealed with a

1)
Quanti-Tray Sealer and then incubated at (36 ± 2) °C for 18 h to 22 h.
After incubation, sample wells that have a yellow colour of equal or greater intensity than that of the
comparator wells are considered positive for coliform bacteria. Yellow wells that also exhibit any degree of
fluorescence are considered positive for E. coli.
By means of statistical tables, or a simple computer program, the most probable number (MPN) of coliform
bacteria and E. coli in 100 ml of the sample can be determined.
NOTE The yellow colouration can be seen with the naked eye and results from the cleavage of ortho-nitrophenol
galactoside by the enzyme -D-galactosidase. The fluorescence is demonstrable under ultraviolet light (365 nm) and
originates from the cleavage of the molecule 4-methylumbelliferyl glucuronide (MUG) by the enzyme -D-glucuronidase to
produce the fluorescent compound methyl umbelliferone.
5 Apparatus and glassware
Use microbiological laboratory equipment and, in particular, the following:
5.1 Apparatus for sterilization by steam (autoclave)
Apparatus and glassware not supplied sterile shall be sterilized according to the instructions given in
ISO 8199.
5.2 Hot air oven, for dry heat sterilization.
5.3 Incubator, thermostatically controlled at (36 ± 2) °C.
1)
5.4 Quanti-Tray sealer.
5.5 Sterile wide mouthed vessels of at least 110 ml.

1) Quanti-Tray is a trademark or registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States
and/or other countries. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 9308 and does not
constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2012 – All rights reserved

2)
5.6 Quanti-Tray comparator.
5.7 Ultraviolet lamp, 365 nm.
2) 2)
/
5.8 Quanti-Tray or Quanti-Tray 2000 , see Annex B.
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials
3)
The method utilises Colilert -18 a medium based on the Defined Substrate Technology available for a 100 ml
sample as a ready to use powder dispensed in snap packs. Each snap pack contains sufficient medium
(2,8 g) for a single test. Medium is stored under ambient conditions (2 °C to 25 °C) out of direct sunlight and
should be used before the expiry date listed on the snap pack.
The medium is composed of two components to give the final concentrations as shown in Annex C.
6.2 Diluent
3)
For dilutions to be used with Colilert -18, use only sterile, non-inhibitory, oxidant-free water (deionized or tap).
The use of buffered, saline or peptone-containing diluents interferes with the performance of the test.
6.3 Antifoam B
Antifoam B is a 10 % active, water soluble suspension of silicone.
7 Sampling
Take the samples and deliver them to the laboratory in accordance with ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Preparation of the sample
Samples should be transported and stored at (5  3) °C in accordance with ISO 19458 and analys
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9308-2
Deuxième édition
2012-07-01
Qualité de l’eau — Dénombrement
des Escherichia coli et des bactéries
coliformes —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2: Most probable number method
Numéro de référence
©
ISO 2012
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2012
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2013
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Appareillage et verrerie . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 3
6.1 Substances de base . 3
6.2 Diluant . 3
6.3 Antimousse B . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire. 3
8.1 Préparation de l’échantillon . 3
8.2 Ensemencement des milieux . 3
8.3 Incubation et différenciation . 4
8.4 Examen des résultats . 4
9 Expression des résultats. 4
10 Rapport d’essai . 4
11 Assurance qualité . 5
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur les
bactéries coliformes . 6
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats . 7
Annexe C (informative) Composition du milieu Colilert-18 .40
8)
Annexe D (informative) Validation de Colilert-18/Quanti-Tray pour le dénombrement des E. coli
et des bactéries coliformes présentes dans l’eau .42
Bibliographie .43
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’ISO 9308-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4,
Méthodes microbiologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 9308-2:1990), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau —
Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes:
— Partie 1: Méthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant peu de flore bactérienne de fond
— Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
— Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour la recherche et le dénombrement des
E. coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés

Introduction
La présence et l’étendue de la pollution fécale est un facteur important dans l’évaluation de la qualité d’une
masse d’eau ainsi que du risque infectieux représenté pour la santé humaine. L’examen d’échantillons
d’eau pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement présents dans les intestins de l’homme
et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce type de pollution. Les résultats de l’examen
des bactéries coliformes peuvent s’avérer plus difficiles à interpréter en raison du fait que certains
coliformes vivent également dans le sol et dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours
d’origine intestinale. La présence de bactéries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve
d’une contamination d’origine fécale, indiquer une défaillance du traitement ou une infiltration d’eau
dans le système de distribution de l’eau.
L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait que la conformité au
présent document peut impliquer l’utilisation de brevets concernant Colilert-18, Quanti-Tray et Quanti-
Tray 2000 donnés dans le présent document.
L’ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application du droit
de propriété industrielle concerné.
Le titulaire de ce brevet a assuré à l’ISO qu’il était disposé à négocier les licences, à titre gracieux ou
dans des conditions raisonnables et non discriminatoires, avec des demandeurs du monde entier. À cet
égard, la déclaration du titulaire de ce brevet est enregistrée auprès de l’ISO. Il est possible d’obtenir des
informations aux adresses suivantes:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 États-Unis
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle autres que ceux identifiés ci-dessus. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO (http://www.iso.org/patents) et le CEI (http://patents.iec.ch) tiennent à jour des bases de données
en ligne des brevets correspondant à leurs normes. Les utilisateurs sont encouragés à consulter les bases
de données afin d’obtenir les informations les plus récentes sur les brevets.
NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2:2012(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries coliformes —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente partie de l’ISO 9308 connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale ne prétend pas traiter
tous les éventuels problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir
des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à
la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente partie de l’ISO 9308
soient effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode de dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries coliformes dans l’eau. La méthode est basée sur la croissance d’organismes cibles dans un
milieu liquide et sur le calcul du « nombre le plus probable » d’organismes en fonction de tables NPP. Cette
méthode peut être appliquée à tous les types d’eau, y compris ceux contenant une quantité appréciable
de matière en suspension et des nombres importants de bactéries hétérotrophes. Cependant, elle ne doit
pas être utilisée pour dénombrer les bactéries coliformes dans l’eau de mer. Lorsqu’elle est utilisée pour
dénombrer Escherichia coli dans l’eau de mer, une dilution 1→10 dans de l’eau stérile est généralement
requise, bien que la méthode ait démontré son efficacité avec certaines eaux de mer ayant une
concentration en sel inférieure à la normale. En l’absence de données étayant l’utilisation de la méthode
sans dilution, une dilution 1→10 est utilisée.
Cette méthode repose sur la détection des Escherichia coli en fonction de l’expression de l’enzyme β-D-
glucuronidase et, par conséquent, ne permet pas de détecter les souches entérohémorragiques des
Escherichia coli, qui n’expriment généralement pas cette enzyme. De plus, il existe un petit nombre
d’autres souches d’Escherichia coli qui n’expriment pas la β-D-glucuronidase.
Le choix des essais utilisés lors de la détection et de la confirmation du groupe de bactéries coliformes,
notamment Escherichia coli, peut être considéré comme faisant partie intégrante d’une séquence
continue. Le niveau de confirmation avec un échantillon particulier dépend d’une part de la nature de
l’eau et d’autre part des raisons de l’examen. L’essai décrit dans la présente partie de l’ISO 9308 fournit
un résultat confirmé sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
NOTE Bien que cette méthode décrive l’utilisation d’un dispositif de dénombrement disponible dans le
commerce, le milieu décrit ici peut également être utilisé dans un format NPP standard.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
Guide ISO/CEI 2:2004, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants et ceux donnés dans le
Guide ISO/CEI 2 s’appliquent.
3.1
bactérie coliforme
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime l’enzyme β-D-galactosidase
3.2
Escherichia coli
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime les enzymes β-D-galactosidase et β-D-glucuronidase
4 Principe
Un sachet de milieu déshydra
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9308-2
Deuxième édition
2012-07-01
Qualité de l’eau — Dénombrement
des Escherichia coli et des bactéries
coliformes —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform
bacteria —
Part 2: Most probable number method
Numéro de référence
©
ISO 2012
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2012
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2013
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Appareillage et verrerie . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 3
6.1 Substances de base . 3
6.2 Diluant . 3
6.3 Antimousse B . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire. 3
8.1 Préparation de l’échantillon . 3
8.2 Ensemencement des milieux . 3
8.3 Incubation et différenciation . 4
8.4 Examen des résultats . 4
9 Expression des résultats. 4
10 Rapport d’essai . 4
11 Assurance qualité . 5
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur les
bactéries coliformes . 6
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats . 7
Annexe C (informative) Composition du milieu Colilert-18 .40
8)
Annexe D (informative) Validation de Colilert-18/Quanti-Tray pour le dénombrement des E. coli
et des bactéries coliformes présentes dans l’eau .42
Bibliographie .43
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’ISO 9308-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4,
Méthodes microbiologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 9308-2:1990), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau —
Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes:
— Partie 1: Méthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant peu de flore bactérienne de fond
— Partie 2: Méthode du nombre le plus probable
— Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour la recherche et le dénombrement des
E. coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés

Introduction
La présence et l’étendue de la pollution fécale est un facteur important dans l’évaluation de la qualité d’une
masse d’eau ainsi que du risque infectieux représenté pour la santé humaine. L’examen d’échantillons
d’eau pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement présents dans les intestins de l’homme
et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce type de pollution. Les résultats de l’examen
des bactéries coliformes peuvent s’avérer plus difficiles à interpréter en raison du fait que certains
coliformes vivent également dans le sol et dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours
d’origine intestinale. La présence de bactéries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve
d’une contamination d’origine fécale, indiquer une défaillance du traitement ou une infiltration d’eau
dans le système de distribution de l’eau.
L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait que la conformité au
présent document peut impliquer l’utilisation de brevets concernant Colilert-18, Quanti-Tray et Quanti-
Tray 2000 donnés dans le présent document.
L’ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application du droit
de propriété industrielle concerné.
Le titulaire de ce brevet a assuré à l’ISO qu’il était disposé à négocier les licences, à titre gracieux ou
dans des conditions raisonnables et non discriminatoires, avec des demandeurs du monde entier. À cet
égard, la déclaration du titulaire de ce brevet est enregistrée auprès de l’ISO. Il est possible d’obtenir des
informations aux adresses suivantes:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 États-Unis
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle autres que ceux identifiés ci-dessus. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO (http://www.iso.org/patents) et le CEI (http://patents.iec.ch) tiennent à jour des bases de données
en ligne des brevets correspondant à leurs normes. Les utilisateurs sont encouragés à consulter les bases
de données afin d’obtenir les informations les plus récentes sur les brevets.
NORME INTERNATIONALE ISO 9308-2:2012(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries coliformes —
Partie 2:
Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente partie de l’ISO 9308 connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale ne prétend pas traiter
tous les éventuels problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir
des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à
la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente partie de l’ISO 9308
soient effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode de dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries coliformes dans l’eau. La méthode est basée sur la croissance d’organismes cibles dans un
milieu liquide et sur le calcul du « nombre le plus probable » d’organismes en fonction de tables NPP. Cette
méthode peut être appliquée à tous les types d’eau, y compris ceux contenant une quantité appréciable
de matière en suspension et des nombres importants de bactéries hétérotrophes. Cependant, elle ne doit
pas être utilisée pour dénombrer les bactéries coliformes dans l’eau de mer. Lorsqu’elle est utilisée pour
dénombrer Escherichia coli dans l’eau de mer, une dilution 1→10 dans de l’eau stérile est généralement
requise, bien que la méthode ait démontré son efficacité avec certaines eaux de mer ayant une
concentration en sel inférieure à la normale. En l’absence de données étayant l’utilisation de la méthode
sans dilution, une dilution 1→10 est utilisée.
Cette méthode repose sur la détection des Escherichia coli en fonction de l’expression de l’enzyme β-D-
glucuronidase et, par conséquent, ne permet pas de détecter les souches entérohémorragiques des
Escherichia coli, qui n’expriment généralement pas cette enzyme. De plus, il existe un petit nombre
d’autres souches d’Escherichia coli qui n’expriment pas la β-D-glucuronidase.
Le choix des essais utilisés lors de la détection et de la confirmation du groupe de bactéries coliformes,
notamment Escherichia coli, peut être considéré comme faisant partie intégrante d’une séquence
continue. Le niveau de confirmation avec un échantillon particulier dépend d’une part de la nature de
l’eau et d’autre part des raisons de l’examen. L’essai décrit dans la présente partie de l’ISO 9308 fournit
un résultat confirmé sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
NOTE Bien que cette méthode décrive l’utilisation d’un dispositif de dénombrement disponible dans le
commerce, le milieu décrit ici peut également être utilisé dans un format NPP standard.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
Guide ISO/CEI 2:2004, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants et ceux donnés dans le
Guide ISO/CEI 2 s’appliquent.
3.1
bactérie coliforme
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime l’enzyme β-D-galactosidase
3.2
Escherichia coli
membre de la famille des Entérobactéries qui exprime les enzymes β-D-galactosidase et β-D-glucuronidase
4 Principe
Un sachet de milieu déshydra
...

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 9308-2
Второе издание
2012-07-01
Качество воды. Подсчет кишечных
палочек Escherichia coli и
колиформных бактерий.
Часть 2.
Метод наиболее вероятного
количества
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 2: Most probable number method

Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочный номер
©
ISO 2012
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ

©  ISO 2012
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2012 – Все права сохраняются

Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .2
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.2
5 Аппаратура и стеклянная посуда .3
6 Питательные среды и реактивы .4
7 Отбор проб.4
8 Процедура.4
9 Выражение результатов .5
10 Протокол испытания.5
11 Гарантия качества .6
Приложение А (информативное) Дополнительная информация о колиформных бактериях .7
5)
Приложение В (нормативное) Герметизатор Quanti-Tray и вычисление результатов .8
Приложение С (информативное) Состав питательной среды Colilert-18.44
8)
Приложение D (информативное) Валидация метода Colilert-18/Quanti-Tray для подсчета
E.coli и колиформных бактерий в воде .46
Библиография.48

Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO
работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
ISO 9308-2 подготовлен Техническим Комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 4,
Микробиологические методы.
Настоящее второе издание отменяет и заменяет первое издание (ISO 9308-2:1990), которое было
технически пересмотрено.
ISO 9308 состоит из следующих частей под общим названием Качество воды. Подсчет кишечных
палочек Escherichia coli и колиформных бактерий:
⎯ Часть 1. Метод мембранной фильтрации для вод с низкой бактериальной фоновой флорой
⎯ Часть 2. Метод наиболее вероятного количества
⎯ Часть 3. Миниатюризированный метод (наиболее вероятное количество) для выявления и
подсчета E. coli в поверхностных и сточных водах

iv © ISO 2012 – Все права сохраняются

Введение
Присутствие и степень фекального загрязнения является важным фактором в оценке качества
водоема и риска инфекционных заболеваний для человека. Исследование проб воды на присутствие
кишечной палочки Escherichia coli (E. coli), которая обычно обитает в теле человека и теплокровных
животных, дает показатель такого загрязнения. Анализ на присутствие колиформных бактерий может
быть более трудным для интерпретации, потому что некоторые колиформные бактерии живут в почве
и пресных поверхностных водах, но не всегда являются кишечными. Тем не менее, наличие
колиформных бактерий, хотя и не является доказательством фекального загрязнения, может
указывать на нарушения очистки или поступления воды в распределительную систему.
Международная организация по стандартизации (ISO) обращает внимание на тот факт, что заявление
о соответствии этому документу может включать также использование патентов на Colilert-18, Quanti-
Tray и Quanti-Tray 2000, указанных в данном документе.
ISO не имеет никакого отношения к доказательству, юридической силе и области применения этих
патентных прав.
ISO было получено заверение от обладателя настоящего патентного права относительно его/её
готовности к лицензионным договорам с заявителями из любой страны безвозмездно или на разумных
и недискриминационных условиях. Информацию можно получить из:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 USA
Обращается внимание на то, что часть элементов в настоящем документе может подлежать
патентным правам, не идентифицированным выше. ISO не несет ответственности за идентификацию
таких патентных прав.
ISO (http://www.iso.org/patents) и IEC (http://patents.iec.ch) ведут в режиме онлайн базы патентных
данных, соответствующих их стандартам. Пользователям рекомендуется обращаться к этим базам
данных для получения самой последней информации относительно патентов.

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 9308-2:2012(R)

Качество воды. Подсчет кишечных палочек Escherichia coli
и колиформных бактерий.
Часть 2.
Метод наиболее вероятного количества
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ Лица, использующие эту часть ISO 9308 должны быть знакомы с
нормальной лабораторной практикой. В настоящем международном стандарте не
предусматривается рассмотрение всех проблем безопасности, если таковые имеются,
связанных с его использованием. Пользователь сам должен установить надлежащие
нормативы по технике безопасности и защите здоровья и обеспечить их соответствие
условиям национального регулирования.
ВАЖНО Весьма важно, чтобы испытания согласно этой части ISO 9308 проводились
персоналом с соответствующей квалификацией.
1 Область применения
В настоящей части ISO 9308 устанавливается метод для подсчета кишечных палочек E. coli и
колиформных бактерий в воде. Метод основан на выращивании целевых организмов в жидкой среде и
вычислении “наиболее вероятного количества” (MPN) организмов с помощью таблицы MPN. Этот
метод можно применять для всех типов воды, включая те, которые содержат значительное количество
взвеси и высокие фоновые количества гетеротрофных бактерий. Однако он не должен использоваться
для подсчета колиформных бактерий в морской воде. При подсчете E. coli в морских водах обычно
требуется разведение 1→10 в стерильной воде, хотя есть данные, что этот метод вполне подходит
для некоторых морских вод, в которых концентрация солей ниже обычных значений. При отсутствии
данных для поддержки использования этого метода без разведения используется разведение 1→10.
Этот метод состоит в обнаружении E. coli на основе экспрессии энзима β-D-глюкуронидазы, и
следовательно он не дает возможности для выявления многих из энтерогеморрагических штаммов
E. coli, которые не типично экспрессируют этот энзим. Кроме того, имеется небольшое количество
других штаммов E. coli , которые не экспрессируют β-D-глюкуронидазу.
Выбор тестов, используемых для обнаружения и подтверждения колиформной группы бактерий,
включая E. coli, можно рассматривать как часть непрерывной последовательности. Степень
подтверждения на конкретной пробе частично зависит от природы воды и частично от целей
исследования. Испытание, описанное в этой части ISO 9308, дает подтвержденный результат без
требования дополнительного подтверждения положительных лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ Хотя этот метод включает использование счетного устройства, которое имеется в продаже,
описанная здесь питательная среда может также использоваться в стандартном формате MPN.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы, целиком или частично, являются обязательными при
применении данного документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание
документа. Для плавающих ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного
ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 8199, Качество воды. Общее руководство по подсчету микроорганизмов, выращенных методом
посева на питательной среде
ISO/IEC Guide 2:2004, Стандартизация и смежные виды деятельности. Общий словарь
ISO 19458, Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа
3 Термины и определения
В данной части этого документа применяются термины и определения, приведенные в ISO/IEC Guide 2,
а также указанные ниже.
3.1
колиформная бактерия
coliform bacterium
представитель семейства энтеробактерий, который экспрессирует энзим β-D-галактозидазу
3.2
кишечная палочка
Escherichia coli
представитель семейства энтеробактерий, который экспрессирует не только энзим β-D-галактозидазу,
но и β-D-глюкуронидазу
4 Сущность метода
Разовую упаковку дегидратированной питательной среды добавляют к пробе воды (100 мл) или к
разведению пробы, приготовленному до 100 мл. Пробу с питательной средой мягко встряхивают,
чтобы обеспечить адекватное смешивание и растворение среды. Затем пробу с питательной средой,
1)
1)
соблюдая стерильность, выливают на планшеты Quanti-Tray или Quanti-Tray/2000 для подсчета
вплоть до 201 организма или 2 419 организмов на 100 мл соответственно. Планшеты запечатывают с

1)
помощью герметизатора Quanti-Tray Sealer и затем инкубируют при (36 ± 2) °C в течение 18 ч до 22 ч.

1) Quanti-Tray торговая марка или зарегистрированная торговая марка фирмы IDEXX Laboratories, Inc. или ее
филиалов в Соединенных штатах и/или других странах. Эта информация дается для удобства пользователей этой
части ISO 9308 и не является рекомендацией ISO для этого продукта.
2 © ISO 2012 – Все права сохраняются

После инкубации лунки с пробой, которые имеют желтую окраску одинаковой или большей
интенсивности по сравнению с лунками компаратора, считаются положительными для колиформных
бактерий. Желтые лунки, которые также показывают некоторую степень флуоресценции, считаются
положительными для E. coli.
С помощью статистических таблиц или простой компьютерной программы можно определить наиболее
вероятное количество (MPN) колиформных бактерий и E. coli в 100 мл пробы.
ПРИМЕЧАНИЕ Желтая окраска может быть видна невооруженным глазом и является результатом
расщепления орто-нитрофенол-галактозида энзимом β-D-галактозидазой. Флуоресценция явно наблюдается при
ультрафиолетовом свете (365 нм) и возникает из расщепления молекулы 4-метилумбеллиферил-глюкуронида
(MUG) энзимом β-D-глюкуронидазой с образованием флуоресцирующего продукта метилумбеллиферона.
5 Аппаратура и стеклянная посуда
Используется микробиологическое лабораторное оборудование и, в частности, следующая:
5.1 Аппаратура для стерилизации паром (автоклав)
Аппаратура и стеклянная посуда, поставляемые в нестерильном состоянии, должны быть
стерилизованы согласно инструкциям, данным в ISO 8199.
5.2 Сушильный шкаф, для стерилизации сухим жаром.
5.3 Инкубатор, с термостатическим регулированием при (36 ± 2) °C.
1)
5.4 Герметизатор Quanti-Tray .
5.5 Стерильные широкогорлые сосуды вместимостью не менее 110 мл.
2)
5.6 Компаратор Quanti-Tray .
5.7 Ультрафиолетовая лампа, 365 нм.
2) 2)
/
5.8 Планшеты Quanti-Tray или Quanti-Tray 2000 , см. Приложение B.

2) Quanti-Tray торговая марка или зарегистрированная торговая марка фирмы IDEXX Laboratories, Inc. или ее
филиалов в Соединенных штатах и/или других странах. Эта информация дается для удобства пользователей этой
части ISO 9308 и не является рекомендацией ISO для этого продукта.
6 Питательные среды и реактивы
6.1 Основные материалы
3)
В данном методе используется питательная среда Colilert -18, приготовленная на основе технологии
определенного субстрата и имеющаяся в наличии для 100 мл
...

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 9308-2
Второе издание
2012-07-01
Качество воды. Подсчет кишечных
палочек Escherichia coli и
колиформных бактерий.
Часть 2.
Метод наиболее вероятного
количества
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 2: Most probable number method

Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочный номер
©
ISO 2012
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ

©  ISO 2012
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2012 – Все права сохраняются

Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .2
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.2
5 Аппаратура и стеклянная посуда .3
6 Питательные среды и реактивы .4
7 Отбор проб.4
8 Процедура.4
9 Выражение результатов .5
10 Протокол испытания.5
11 Гарантия качества .6
Приложение А (информативное) Дополнительная информация о колиформных бактериях .7
5)
Приложение В (нормативное) Герметизатор Quanti-Tray и вычисление результатов .8
Приложение С (информативное) Состав питательной среды Colilert-18.44
8)
Приложение D (информативное) Валидация метода Colilert-18/Quanti-Tray для подсчета
E.coli и колиформных бактерий в воде .46
Библиография.48

Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO
работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
ISO 9308-2 подготовлен Техническим Комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 4,
Микробиологические методы.
Настоящее второе издание отменяет и заменяет первое издание (ISO 9308-2:1990), которое было
технически пересмотрено.
ISO 9308 состоит из следующих частей под общим названием Качество воды. Подсчет кишечных
палочек Escherichia coli и колиформных бактерий:
⎯ Часть 1. Метод мембранной фильтрации для вод с низкой бактериальной фоновой флорой
⎯ Часть 2. Метод наиболее вероятного количества
⎯ Часть 3. Миниатюризированный метод (наиболее вероятное количество) для выявления и
подсчета E. coli в поверхностных и сточных водах

iv © ISO 2012 – Все права сохраняются

Введение
Присутствие и степень фекального загрязнения является важным фактором в оценке качества
водоема и риска инфекционных заболеваний для человека. Исследование проб воды на присутствие
кишечной палочки Escherichia coli (E. coli), которая обычно обитает в теле человека и теплокровных
животных, дает показатель такого загрязнения. Анализ на присутствие колиформных бактерий может
быть более трудным для интерпретации, потому что некоторые колиформные бактерии живут в почве
и пресных поверхностных водах, но не всегда являются кишечными. Тем не менее, наличие
колиформных бактерий, хотя и не является доказательством фекального загрязнения, может
указывать на нарушения очистки или поступления воды в распределительную систему.
Международная организация по стандартизации (ISO) обращает внимание на тот факт, что заявление
о соответствии этому документу может включать также использование патентов на Colilert-18, Quanti-
Tray и Quanti-Tray 2000, указанных в данном документе.
ISO не имеет никакого отношения к доказательству, юридической силе и области применения этих
патентных прав.
ISO было получено заверение от обладателя настоящего патентного права относительно его/её
готовности к лицензионным договорам с заявителями из любой страны безвозмездно или на разумных
и недискриминационных условиях. Информацию можно получить из:
IDEXX Laboratories, Inc.
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine 04092 USA
Обращается внимание на то, что часть элементов в настоящем документе может подлежать
патентным правам, не идентифицированным выше. ISO не несет ответственности за идентификацию
таких патентных прав.
ISO (http://www.iso.org/patents) и IEC (http://patents.iec.ch) ведут в режиме онлайн базы патентных
данных, соответствующих их стандартам. Пользователям рекомендуется обращаться к этим базам
данных для получения самой последней информации относительно патентов.

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 9308-2:2012(R)

Качество воды. Подсчет кишечных палочек Escherichia coli
и колиформных бактерий.
Часть 2.
Метод наиболее вероятного количества
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ Лица, использующие эту часть ISO 9308 должны быть знакомы с
нормальной лабораторной практикой. В настоящем международном стандарте не
предусматривается рассмотрение всех проблем безопасности, если таковые имеются,
связанных с его использованием. Пользователь сам должен установить надлежащие
нормативы по технике безопасности и защите здоровья и обеспечить их соответствие
условиям национального регулирования.
ВАЖНО Весьма важно, чтобы испытания согласно этой части ISO 9308 проводились
персоналом с соответствующей квалификацией.
1 Область применения
В настоящей части ISO 9308 устанавливается метод для подсчета кишечных палочек E. coli и
колиформных бактерий в воде. Метод основан на выращивании целевых организмов в жидкой среде и
вычислении “наиболее вероятного количества” (MPN) организмов с помощью таблицы MPN. Этот
метод можно применять для всех типов воды, включая те, которые содержат значительное количество
взвеси и высокие фоновые количества гетеротрофных бактерий. Однако он не должен использоваться
для подсчета колиформных бактерий в морской воде. При подсчете E. coli в морских водах обычно
требуется разведение 1→10 в стерильной воде, хотя есть данные, что этот метод вполне подходит
для некоторых морских вод, в которых концентрация солей ниже обычных значений. При отсутствии
данных для поддержки использования этого метода без разведения используется разведение 1→10.
Этот метод состоит в обнаружении E. coli на основе экспрессии энзима β-D-глюкуронидазы, и
следовательно он не дает возможности для выявления многих из энтерогеморрагических штаммов
E. coli, которые не типично экспрессируют этот энзим. Кроме того, имеется небольшое количество
других штаммов E. coli , которые не экспрессируют β-D-глюкуронидазу.
Выбор тестов, используемых для обнаружения и подтверждения колиформной группы бактерий,
включая E. coli, можно рассматривать как часть непрерывной последовательности. Степень
подтверждения на конкретной пробе частично зависит от природы воды и частично от целей
исследования. Испытание, описанное в этой части ISO 9308, дает подтвержденный результат без
требования дополнительного подтверждения положительных лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ Хотя этот метод включает использование счетного устройства, которое имеется в продаже,
описанная здесь питательная среда может также использоваться в стандартном формате MPN.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы, целиком или частично, являются обязательными при
применении данного документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание
документа. Для плавающих ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного
ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 8199, Качество воды. Общее руководство по подсчету микроорганизмов, выращенных методом
посева на питательной среде
ISO/IEC Guide 2:2004, Стандартизация и смежные виды деятельности. Общий словарь
ISO 19458, Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа
3 Термины и определения
В данной части этого документа применяются термины и определения, приведенные в ISO/IEC Guide 2,
а также указанные ниже.
3.1
колиформная бактерия
coliform bacterium
представитель семейства энтеробактерий, который экспрессирует энзим β-D-галактозидазу
3.2
кишечная палочка
Escherichia coli
представитель семейства энтеробактерий, который экспрессирует не только энзим β-D-галактозидазу,
но и β-D-глюкуронидазу
4 Сущность метода
Разовую упаковку дегидратированной питательной среды добавляют к пробе воды (100 мл) или к
разведению пробы, приготовленному до 100 мл. Пробу с питательной средой мягко встряхивают,
чтобы обеспечить адекватное смешивание и растворение среды. Затем пробу с питательной средой,
1)
1)
соблюдая стерильность, выливают на планшеты Quanti-Tray или Quanti-Tray/2000 для подсчета
вплоть до 201 организма или 2 419 организмов на 100 мл соответственно. Планшеты запечатывают с

1)
помощью герметизатора Quanti-Tray Sealer и затем инкубируют при (36 ± 2) °C в течение 18 ч до 22 ч.

1) Quanti-Tray торговая марка или зарегистрированная торговая марка фирмы IDEXX Laboratories, Inc. или ее
филиалов в Соединенных штатах и/или других странах. Эта информация дается для удобства пользователей этой
части ISO 9308 и не является рекомендацией ISO для этого продукта.
2 © ISO 2012 – Все права сохраняются

После инкубации лунки с пробой, которые имеют желтую окраску одинаковой или большей
интенсивности по сравнению с лунками компаратора, считаются положительными для колиформных
бактерий. Желтые лунки, которые также показывают некоторую степень флуоресценции, считаются
положительными для E. coli.
С помощью статистических таблиц или простой компьютерной программы можно определить наиболее
вероятное количество (MPN) колиформных бактерий и E. coli в 100 мл пробы.
ПРИМЕЧАНИЕ Желтая окраска может быть видна невооруженным глазом и является результатом
расщепления орто-нитрофенол-галактозида энзимом β-D-галактозидазой. Флуоресценция явно наблюдается при
ультрафиолетовом свете (365 нм) и возникает из расщепления молекулы 4-метилумбеллиферил-глюкуронида
(MUG) энзимом β-D-глюкуронидазой с образованием флуоресцирующего продукта метилумбеллиферона.
5 Аппаратура и стеклянная посуда
Используется микробиологическое лабораторное оборудование и, в частности, следующая:
5.1 Аппаратура для стерилизации паром (автоклав)
Аппаратура и стеклянная посуда, поставляемые в нестерильном состоянии, должны быть
стерилизованы согласно инструкциям, данным в ISO 8199.
5.2 Сушильный шкаф, для стерилизации сухим жаром.
5.3 Инкубатор, с термостатическим регулированием при (36 ± 2) °C.
1)
5.4 Герметизатор Quanti-Tray .
5.5 Стерильные широкогорлые сосуды вместимостью не менее 110 мл.
2)
5.6 Компаратор Quanti-Tray .
5.7 Ультрафиолетовая лампа, 365 нм.
2) 2)
/
5.8 Планшеты Quanti-Tray или Quanti-Tray 2000 , см. Приложение B.

2) Quanti-Tray торговая марка или зарегистрированная торговая марка фирмы IDEXX Laboratories, Inc. или ее
филиалов в Соединенных штатах и/или других странах. Эта информация дается для удобства пользователей этой
части ISO 9308 и не является рекомендацией ISO для этого продукта.
6 Питательные среды и реактивы
6.1 Основные материалы
3)
В данном методе используется питательная среда Colilert -18, приготовленная на основе технологии
определенного субстрата и имеющаяся в наличии для 100 мл
...