ISO 11781:2025
(Main)Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance for single-laboratory validation of qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance for single-laboratory validation of qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
This document specifies minimum requirements and minimum performance criteria for conducting a single-laboratory validation study for qualitative (binary) real-time polymerase chain reaction (PCR) methods applied to the detection of specific DNA sequences present in foods. The document is applicable to any single-laboratory validation of a qualitative real-time PCR method used for the detection of specific DNA sequences in food and food products (e.g. for the detection of genetically modified foodstuffs and for species determination, including species known to produce allergenic proteins). The document does not apply to single laboratory validation of qualitative microbiological real-time PCR methods. The document does not apply to the evaluation of applicability and practicability with respect to the specific scope of the PCR method.
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Exigences et recommandations pour la validation intralaboratoire des méthodes de PCR qualitative en temps réel
Le présent document spécifie les exigences minimales et les critères de performance minimaux pour la réalisation d’une étude de validation intralaboratoire relative aux méthodes de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qualitative (binaire) en temps réel appliquées à la détection de séquences d’ADN spécifiques présentes dans les aliments. Le document est applicable à toute validation intralaboratoire de méthode de PCR qualitative en temps réel utilisée pour la détection de séquences d’ADN spécifiques dans les aliments et les produits alimentaires (par exemple pour la détection de produits alimentaires génétiquement modifiés et la détermination d’espèces, y compris les espèces connues pour produire des protéines allergènes). Le document ne s’applique pas à la validation intralaboratoire de méthodes de PCR qualitative en temps réel utilisées en microbiologie. Le document ne s’applique pas à l’évaluation de l’applicabilité et de la faisabilité en ce qui concerne le domaine d’application spécifique de la méthode de PCR.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 11781
First edition
Molecular biomarker analysis —
2025-04
Requirements and guidance for
single-laboratory validation of
qualitative real-time polymerase
chain reaction (PCR) methods
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Exigences et
recommandations pour la validation intralaboratoire des
méthodes de PCR qualitative en temps réel
Reference number
© ISO 2025
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Single-laboratory validation of the performance characteristics . 2
5.1 General .2
5.2 Limit of detection .2
5.3 Determining copies of DNA target sequences in DNA test materials .3
5.4 Evaluation of data for the limit of detection .3
5.5 PCR efficiency and variability of the measured copy number around the limit of
detection .4
5.6 Specificity .4
5.6.1 General .4
5.6.2 Bioinformatic (in silico) test for specificity .4
5.6.3 Practical test for specificity .4
5.6.4 Robustness . .5
6 Validation report . 6
Annex A (informative) Estimation of the number of copies of the DNA target sequence . 7
Annex B (informative) Determination of limit of detection, precision and PCR efficiency . 9
Annex C (informative) Generalized linear mixed model with log-log link .13
Annex D (informative) Robustness testing . 19
Bibliography .21
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis, in collaboration with the European Committee for
Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 275, Food analysis - Horizontal methods, in accordance
with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods currently find broad application for the
detection of specific DNA sequences in food (e.g. for the detection and identification of genetically modified
organisms and the products derived thereof, for food authentication and speciation and for other purposes). It
is important that a newly developed food analytical method is fit for purpose and meets certain performance
characteristics and quality criteria as demonstrated by a particular set of validation experiments.
The data determined by the single laboratory validation are the basis for the decision to apply a method
in-house. Furthermore, it helps to decide whether the method in question should be fully validated in
the framework of a collaborative study. The statistical model described has been practically applied, e.g.
[1][2] [3]
some parts of the ISO/TS 21569 series and ISO/TS 20224 series . Other models can be applicable, see
[4]
ISO/TS 16393 .
The aim of this document is to provide a protocol for single-laboratory validation of qualitative real-time
PCR methods that are applied for food analysis. Procedures for DNA extraction from the food matrix are not
included in this document. The procedure described is a recommendation which is underpinned by practical
experience in several laboratories. Alternate approaches may be applied if they can be shown to meet the
performance criteria set in this document.
v
International Standard ISO 11781:2025(en)
Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance
for single-laboratory validation of qualitative real-time
polymerase chain reaction (PCR) methods
1 Scope
This document specifies minimum requirements and minimum performance criteria for conducting a single-
laboratory validation study for qualitative (binary) real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
applied to the detection of specific DNA sequences present in foods.
The document is applicable to any single-laboratory validation of a qualitative real-time PCR method used
for the detection of specific DNA sequences in food and food products (e.g. for the detection of genetically
modified foodstuffs and for species determination, including species known to produce allergenic proteins).
The document does not apply to single laboratory validation of qualitative microbiological real-time PCR
methods.
The document does not apply to the evaluation of applicability and practicability with respect to the specific
scope of the PCR method.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in
agriculture and food production
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Nucleic acid extraction
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
probability of detection
POD
probability of a positive analytical outcome of a qualitative method for a given matrix at a given concentration
in a single laboratory
Note 1 to entry: For a qualitative real-time PCR method, it describes the probability that, for a given number of DNA
copies of the target sequence, PCR amplification will take place.
[SOURCE: ISO 16577:2022, 3.9.12, modified — Note 1 to entry replaced Notes 1 and 2 to entry.]
3.2
polymerase chain reaction efficiency
PCR efficiency
measured amplification rate for a DNA copy of the target sequence per PCR cycle in relation to the
theoretically achievable value of 1
Note 1 to entry: The PCR efficiency is calculated from the slope of a standard curve resulting from the decadic
semi-logarithmic plot of quantification cycle (Cq) values over the DNA concentration. The slope from the calculated
regression line can be used. The PCR efficiency can either be expressed as absolute number or as percentage.
3.3
limit of detection
LOD
95 %
mean number of DNA copies of the target sequence yielding a probability of detection (3.1) of 0,95
3.4
specificity
property of a method to respond exclusively to the characteristic or analyte under investigation
[SOURCE: ISO 24276:2006, 3.1.4]
4 Principle
Specific primers and also probes, depending on the detection system applied, are designed for specific
amplification and detection of a DNA target sequence by a qualitative real-time PCR method. In the next step
for single laboratory validation, the method’s performance characteristics shall be assessed to show that the
[5][6]
method complies with the quality criteria stipulated in relevant documents.
For a qualitative real-time PCR method, the main focus of the validation shall be the limit of detection
(LOD ) (at which the probability of detection (POD) is ≥ 95 %), the specificity for the DNA target sequence
95 %
and the robustness to small but deliberate variations in the method parameters.
On the basis of single laboratory validation data, fulfilment of the minimum required performance criteria
for a qualitative real-time PCR method can be verified and should comprise the basis for applicability of
the method by a single laboratory. A further decision whether to conduct a validation of the method in the
framework of a collaborative study can then be taken.
Determination of the reproducibility (interlaboratory transferability) and how the method performs in
different laboratories, in particular the false-positive/false-negative rate obtained with negative/positive
test samples, and the POD across laboratories, can be evaluated by a collaborative study, if the design is
[6]
appropriate.
5 Single-laboratory validation of the performance characteristics
5.1 General
Guidance for compiling the information required for a complete and detailed description of all components
that should be provided with the protocol of qualitative PCR methods (e.g. oligonucleotide sequences,
amplicon length, instrument or chemistry specifications, PCR conditions, analytical controls) is described in
[8]
other relevant documents, see References [5] and [6] and ISO 21569 .
DNA extraction shall be in accordance with the requirements specified in ISO 21571.
5.2 Limit of detection
The LOD is expressed as the number of copies of the target sequence and shall be determined by means
95 %
of a dilution series of the target DNA, where, in addition to the target DNA, each dilution contains a uniform
concentration of non-target DNA (background DNA).
A minimum of six target DNA concentration levels with 12 replicates per level are required.
The lowest dilution level, i.e. the lowest number of copies for which all 12 replicates are positive, is considered
to be an approximate value for the LOD (see Clause B.2).
95 %
The LOD of qualitative real-time PCR methods should not exceed 20 copies of the target sequence.
95 %
NOTE 1 This document is applicable to the validation of new methods. However, for method verification, 10
replicates can be sufficient.
NOTE 2 If the LOD equals 20 copies of the target sequence, the amplification probability (λ) of the entire PCR is
95 %
[7]
approximately 15 % based on the parameter of the Poisson distribution (λ·LOD = 2,996).
95 %
Annex A provides additional detailed information regarding copy number estimation of target DNA.
Practical guidance for determining the LOD experimentally is given in Annex B.
95 %
Annex C provides the basics of the specific statistical model adapted for PCR methods.
5.3 Determining copies of DNA target sequences in DNA test materials
A determination of copies of DNA target sequences is required for the validation.
The number of copies of the target sequence for a specified mass of nucleic acid (DNA) can be calculated on
basis of haploid genome equivalents using the measured DNA concentration (see ISO 21571:2005, Annex B)
[9][10][11]
and the genome mass. The use of digital PCR equipment (e.g. droplet digital PCR) is an alternative
approach that allows an accurate determination of the number of copies of a DNA target sequence or the
[12]
concentration of a DNA solution.
The quality and the concentration (very high or very low) of the background DNA used for the dilution can
influence the validation experiment. It is therefore highly recommended to use DNA tested for the absence
of PCR inhibitors (e.g. commercial molecular biology grade DNA preparations) and a concentration that is
[13]
relevant for extracted DNA.
5.4 Evaluation of data for the limit of detection
The LOD , the mean POD curve and the 95 % confidence interval should be determined by means of a
95 %
statistical model.
The experimental work that also includes a Poisson component is based on the generalized linear mixed
model (GLMM) with a complementary log-log link function. This model has been found to be most effective
when the DNA copy number is low and follows a Poisson distribution.
Details for the GLMM with complementary log-log link function are given in Annex C. To perform this
calculation, the nominal copies that are added to the PCR reaction, the number of replicates performed and
the number of positive results obtained are required.
Using the results data of the dilution series, the LOD , the 95 % confidence interval and the mean POD
95 %
[14]
curve, along with the corresponding 95 % confidence range, can be calculated via a web service or by
[15]
using the R package POD (see Clause C.5 ).
Check the LOD for plausibility. A value smaller than 2,996 suggests that the number of copies of the
95 %
target sequence that were actually added to the PCR reaction did not correspond to the (nominal) numbers
[7]
of copies estimated for the DNA solutions.
If more than two results are positive at the level with 0,1 copies of the target sequence per PCR, the DNA
dilutions cannot be considered as verified and the number of copies shall be re-examined.
NOTE 1 The calculation of LOD is only valid if false-positive results are negligible, i.e. if the specificity testing
95 %
was successful and PCR carry-over contamination can be excluded.
NOTE 2 The level that will be the result of a tenfold dilution of 1 nominal copy is designated “level with 0,1 copies
per PCR” for the sake of better readability throughout this document.
5.5 PCR efficiency and variability of the measured copy number around the limit of
detection
For an optional determination of the copy number variability around the LOD , assign the copy numbers
95 %
to the respective Cq values on the basis of an additional calibration series of target DNA (for preparation of a
calibration series, see Clause B.2).
The variability of the measured number of copies around LOD should be assessed by comparing the
95 %
repeatability standard deviations with the theoretical values of the Poisson model. An adjusted standard
deviation of > 30 % indicates that the LOD that can be achieved in routine analysis can be subject to high
95 %
variability (see Clause B.5).
The experimental data collected will also permit determination of the PCR efficiency (see Clause B.6),
the slope of the amplification curve and the coefficient of determination (R ). A PCR without inhibitory
influences will amplify as an exponential doubling with a slope (Cq/number of initial copies) of −3,321 9.
An acceptable PCR efficiency should not deviate by more than ±10 % from the theoretical value of 100 %
(corresponding to a slope in the interval −3,1 to −3,6). Where the PCR efficiency is found to be greater
than the theoretical maximum, errors due to reaction setup and PCR inhibition should be considered. The
coefficient of determination should be at least 0,98 (or 98 %).
5.6 Specificity
5.6.1 General
In silico analysis and experimental results from testing the method with genomic sequence databases
and material containing the target sequence shall be provided. If available, testing should be inclusive and
exclusive with relevant and representative data and materials according to the scope of the method.
5.6.2 Bioinformatic (in silico) test for specificity
Bioinformatic specificity tests shall be carried out, examining the oligonucleotide and the amplicon sequences
[16]
with available bioinformatics tools (e.g. primer-dimer formation with primer 3). Homology to other
®1)[17]
sequences shall be tested by searches in nucleic acid sequence databases (e.g. BLAST in GenBank ).
The in silico analysis should not reveal any sequence similarities between the target and the sequences that
can be present in the sample capable of influencing the analytical result. The oligonucleotide sequence(s)
should be adapted accordingly, if appropriate. Additional guidance on in silico analysis can be found in
Reference [18].
5.6.3 Practical test for specificity
Perform tests for unexpected cross-reactions with non-target DNA. Check the PCR detection system for
cross-reactivity with DNA from organisms that have similar (homologous) genetic elements, genes or
genetic constructs. Also check for species that are often present in food as ingredients (e.g. corn, soya, rape
seed, rice, potato, wheat, cattle, chicken, pig, sheep, turkey, horse).
If non-target DNA is tested and a negative result is expected, at least 2 500 copies should be added to
the PCR reaction. If no reference material with sufficiently high concentrations of the non-target DNA is
available, lower concentrations can be used and the number of copies added should be indicated. Verify the
amplifiability of the non-target DNA by means of an independent test.
Perform tests with target DNA. Add target DNA for which a positive result is expected in copy numbers in
the range of the limit of quantification (LOQ) (empirically the copy number for LOD can be multiplied by
95 %
a factor of 3, i.e. in general 20 to 60 copies per PCR). Add non-target DNA at a concentration of 100 ng/25 µl
to 200 ng/25 µl of PCR mix to the target DNA in order to simulate conditions that are relevant in practice
and could influence the outcome. ®
1) BLAST in GenBank is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
It is sufficient to carry out each of the PCR tests for inclusivity (using target DNA) and exclusivity (using non-
target DNA) in duplicate determination.
PCR results for in silico and the experimental analyses should meet or exceed the requirements and criteria
of the method.
If there is cross-reactivity that is considered acceptable, it shall be indicated and taken into account in the
scope of the method.
5.6.4 Robustness
The robustness of a qualitative real-time PCR method shall be evaluated. The evaluation of robustness shall
include small but deliberate variations, e.g. in the following method parameters:
— different types of real-time PCR equipment, if available;
— PCR reagent kits;
— annealing temperature applied in the thermal cycling program;
— master mix volume;
— primer and probe concentrations.
A practicable example of factors and modifications in the procedure conditions controlling all relevant
aspects of qualitative real-time PCR is given in Table 1. Other factors or modifications may be applied if the
gain of sufficient informative value is indicated by the addition.
[19]
Testing should be carried out in a multifactorial experimental design. The PCR reactions with the
different combinations of factors should be done with target DNA at a concentration around the number of
copies corresponding to the LOD multiplied by a factor of 3 (corresponding to approximately 20 to 60
95 %
copies per PCR). Dilute the target DNA in non-target DNA (background DNA), e.g. 20 ng/µl. For each factor-
level combination, PCR tests should at least be performed in triplicate. An example of the procedure is given
in Table D.1.
The method shall yield positive results for all combinations despite the modified conditions.
In the case of negative results, the PCR test for the corresponding combinations shall be repeated. In the
case of repeated negative results, the method is not sufficiently robust and shall be optimized.
Considerable deviations between Cq values can be an indication that the robustness of the method is
insufficient.
Tables 1 and 2 describe statistically proven examples for robustness testing. Other options can be applied
when they produce comparable statistically proven outcomes. If the single laboratory is the basis for a
collaborative study, the tests of several variables is strongly recommended, see Annex D.
Table 1 — Example of a robustness test of factors and modifications in the procedure and conditions
of qualitative real-time PCR methods
Factor 1 0
PCR equipment A B
PCR master mix X Y
Primer concentration unchanged −30 %
Probe concentration unchanged −30 %
Volume of PCR reagent mix Specified volume of PCR rea- Specified volume of PCR reagent
(if total volume is 25 µl) gent mix – 5 % (19 µl) mix + 5 % (21 µl)
+ 5 µl of DNA + 5 µl of DNA
Annealing temperature +1 °C −1 °C
Table 2 — Example of a robustness test by means of an orthogonal experimental design
Factor Combination
1 2 3 4 5 6 7 8
PCR equipment 1 1 1 1 0 0 0 0
PCR master mix 1 1 0 0 1 1 0 0
Primer concentration 1 0 1 0 1 0 1 0
Probe concentration 1 0 0 1 0 1 1 0
Total volume of PCR reagent mix 1 1 0 0 0 0 1 1
Annealing temperature 1 0 1 0 0 1 0 1
An orthogonal experimental design is characterized by the following algorithm: for any pair of factors (e.g.
PCR kit/primer concentration) all four factor-level combinations (1+1, 1+0, 0+1, 0+0) occur with the same
frequency (twice each) (see Table 2). This setup guarantees that possible factorial interaction effects on the
PCR test results can also be detected.
6 Validation report
Information about the results and data obtained by the single-laboratory validation of the performance
characteristics shall be documented in a report.
The report shall contain information about:
a) LOD :
95 %
1) the species of the target DNA;
2) information on how the copy number was assessed for the sensitivity tests;
3) estimated LOD ;
95 %
4) type and quantity of background DNA used;
b) bioinformatic specificity tests:
1) results;
2) database used;
3) date when the database was assessed;
c) practical specificity tests:
1) species from which the DNA was extracted;
2) quantity used per reaction;
3) results;
4) type and quantity of background DNA;
d) robustness:
1) species from which the DNA was extracted;
2) DNA quantity per reaction;
3) parameters changes;
4) results.
Annex A
(informative)
Estimation of the number of copies of the DNA target sequence
A.1 General
The theoretical number of copies of the DNA target sequence can be calculated on basis of haploid genome
equivalents using the measured DNA concentration (see ISO 21571:2005, Annex B) and the genome mass
[9][10][11]
available in the literature or in different databases. The reference values and the reference used shall
be indicated. A list of the mass of the haploid genome of the most relevant species is provided in Table A.1.
The use of digital PCR equipment (e.g. droplet digital PCR) is an alternative approach which allows an
accurate determination
...
Norme
internationale
ISO 11781
Première édition
Analyse de biomarqueurs
2025-04
moléculaires — Exigences
et recommandations pour la
validation intralaboratoire des
méthodes de PCR qualitative en
temps réel
Molecular biomarker analysis — Requirements and guidance for
single-laboratory validation of qualitative real-time polymerase
chain reaction (PCR) methods
Numéro de référence
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Validation intralaboratoire des caractéristiques de performance . 3
5.1 Généralités .3
5.2 Limite de détection .3
5.3 Détermination du nombre de copies de séquences cibles d’ADN dans les matériaux
d’essai d’ADN .3
5.4 Évaluation des données relatives à la limite de détection .3
5.5 Efficacité de la PCR et variabilité du nombre mesuré de copies autour de la limite de
détection .4
5.6 Spécificité .4
5.6.1 Généralités .4
5.6.2 Essai bioinformatique (in silico) de spécificité .4
5.6.3 Essai pratique de spécificité .5
5.6.4 Robustesse .5
6 Rapport de validation . 6
Annexe A (informative) Estimation du nombre de copies de la séquence cible d’ADN . 8
Annexe B (informative) Détermination de la limite de détection, de la fidélité et de l’efficacité
de la PCR . 10
Annexe C (informative) Modèle mixte linéaire généralisé avec lien log-log . 14
Annexe D (informative) Essai de robustesse .20
Bibliographie .22
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse de biomarqueurs moléculaires, en collaboration avec le comité
technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires - Méthodes horizontales, du Comité européen de
normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de
Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Les méthodes de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qualitative en temps réel sont aujourd’hui
largement utilisées pour la détection de séquences d’ADN spécifiques dans les aliments (par exemple
pour la détection et l’identification d’organismes génétiquement modifiés et de leurs produits dérivés,
pour l’authentification et la spéciation des aliments et pour d’autres fins). Il est important qu’une méthode
d’analyse des aliments récemment mise au point soit adaptée à l’usage prévu et réponde à certaines
caractéristiques de performance et certains critères de qualité définis par un ensemble particulier
d’expériences de validation.
Les données déterminées par la validation intralaboratoire servent à décider de l’application d’une
méthode en interne. De plus, elles permettent de déterminer s’il convient que la méthode en question
soit intégralement validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires. Le modèle statistique décrit a été
[1][2]
appliqué dans la pratique, par exemple dans certaines parties de la série ISO/TS 21569 et de la série
[3] [4]
ISO/TS 20224 . D’autres modèles sont applicables, voir l’ISO/TS 16393 .
Le présent document vise à fournir un protocole de validation intralaboratoire des méthodes de PCR
qualitative en temps réel qui sont appliquées dans le domaine de l’analyse des aliments. Les procédures
d’extraction d’ADN de la matrice alimentaire ne figurent pas dans le présent document. Le mode
opératoire décrit est une recommandation étayée par l’expérience pratique dans plusieurs laboratoires.
D’autres approches peuvent être appliquées s’il peut être démontré qu’elles satisfont aux critères de
performance définis dans le présent document.
v
Norme internationale ISO 11781:2025(fr)
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Exigences et
recommandations pour la validation intralaboratoire des
méthodes de PCR qualitative en temps réel
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences minimales et les critères de performance minimaux pour la
réalisation d’une étude de validation intralaboratoire relative aux méthodes de réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) qualitative (binaire) en temps réel appliquées à la détection de séquences d’ADN spécifiques
présentes dans les aliments.
Le document est applicable à toute validation intralaboratoire de méthode de PCR qualitative en temps réel
utilisée pour la détection de séquences d’ADN spécifiques dans les aliments et les produits alimentaires
(par exemple pour la détection de produits alimentaires génétiquement modifiés et la détermination
d’espèces, y compris les espèces connues pour produire des protéines allergènes).
Le document ne s’applique pas à la validation intralaboratoire de méthodes de PCR qualitative en temps réel
utilisées en microbiologie.
Le document ne s’applique pas à l’évaluation de l’applicabilité et de la faisabilité en ce qui concerne le domaine
d’application spécifique de la méthode de PCR.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de biomarqueurs
moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
probabilité de détection
POD
probabilité d’obtenir un résultat d’analyse positif à partir d’une méthode qualitative pour une matrice
donnée à une concentration donnée dans un seul laboratoire
Note 1 à l'article: Pour une méthode de PCR qualitative en temps réel, elle décrit la probabilité que pour un nombre
donné de copies d’ADN de la séquence cible, l’amplification par PCR ait lieu.
[SOURCE: ISO 16577:2022, 3.9.12, modifié — La Note 1 à l’article remplace les Notes 1 et 2 à l’article.]
3.2
efficacité de la réaction de polymérisation en chaîne
efficacité de la PCR
taux d’amplification mesuré pour une copie d’ADN de la séquence cible par cycle PCR par rapport à la valeur
théorique de 1
Note 1 à l'article: L’efficacité de la PCR est calculée d’après la pente d’une courbe d’étalonnage résultant du graphique
semi-logarithmique décimal des valeurs du cycle de quantification (Cq) au-dessus de la concentration d’ADN. La pente
de la droite de régression calculée peut être utilisée. L’efficacité de la PCR peut être exprimée en valeur absolue ou en
pourcentage.
3.3
limite de détection
LOD
95 %
nombre moyen de copies d’ADN de la séquence cible produisant une probabilité de détection (3.1) de 0,95
3.4
spécificité
propriété d’une méthode à répondre exclusivement à la caractéristique ou à l’analyte soumis à essai
[SOURCE: ISO 24276:2006, 3.1.4]
4 Principe
Les amorces spécifiques et les sondes, selon le système de détection appliqué, sont conçues pour
l’amplification et la détection spécifiques d’une séquence cible d’ADN par une méthode de PCR qualitative
en temps réel. À l’étape suivante de la validation intralaboratoire, les caractéristiques de performance de la
méthode doivent être évaluées pour montrer que la méthode est conforme aux critères de qualité stipulés
[5][6]
dans les documents pertinents .
Pour une méthode de PCR qualitative en temps réel, la validation doit porter essentiellement sur la limite de
détection (LOD ) (à laquelle la probabilité de détection (POD) est ≥ 95 %), la spécificité pour la séquence
95 %
d’ADN cible et la robustesse par rapport à des variations faibles mais délibérées appliquées aux paramètres
de la méthode.
Les données de validation intralaboratoire permettent de vérifier si les critères de performance minimaux
requis d’une méthode de PCR qualitative en temps réel sont remplis; il convient que l’applicabilité de la
méthode par un laboratoire individuel soit fondée sur le résultat de cette vérification. Il est possible de
décider ultérieurement d’effectuer une validation de la méthode dans le cadre d’une étude interlaboratoires.
La reproductibilité (transférabilité interlaboratoires) et la performance de méthode dans différents
laboratoires, en particulier le taux de faux positifs/faux négatifs obtenus avec des échantillons pour essai
négatifs/positifs et la POD au sein des laboratoires, peuvent être évaluées par une étude interlaboratoires,
[6]
si la conception est appropriée .
5 Validation intralaboratoire des caractéristiques de performance
5.1 Généralités
Les recommandations pour la compilation des informations requises pour la description complète et détaillée
de tous les éléments qu’il convient de fournir avec le protocole des méthodes de PCR qualitative (comme les
séquences oligonucléotidiques, la longueur de l’amplicon, les spécifications instrumentales ou chimiques,
les conditions de PCR, les contrôles analytiques) sont données dans d’autres documents pertinents, voir les
[8]
Références [5] et [6] et l’ISO 21569 .
L’extraction de l’ADN doit être effectuée conformément aux exigences spécifiées dans l’ISO 21571.
5.2 Limite de détection
La LOD est exprimée comme le nombre de copies de la séquence cible et doit être déterminée par une
95 %
série de dilution de l’ADN cible: outre l’ADN cible, chaque dilution contient une concentration uniforme d’ADN
non cible (ADN d’arrière-plan).
Six niveaux de concentration d’ADN cible au minimum sont requis, avec 12 réplicats par niveau.
Le plus petit niveau de dilution (c’est-à-dire le plus petit nombre de copies) pour lequel la totalité
des 12 réplicats sont positifs est considéré comme étant une valeur approximative de la LOD
95 %
(voir l’Article B.2).
Il convient que la LOD des méthodes de PCR qualitative en temps réel ne dépasse pas 20 copies de la
95 %
séquence cible.
NOTE 1 Le présent document est applicable à la validation de nouvelles méthodes. Cependant, pour la vérification
des méthodes, 10 réplicats peuvent suffire.
NOTE 2 Si la LOD est égale à 20 copies de la séquence cible, la probabilité d’amplification (λ) de toute la PCR est
95 %
[7]
environ de 15 % d’après le paramètre de la distribution de Poisson (λ·LOD = 2,996) .
95 %
L’Annexe A fournit des informations détaillées supplémentaires concernant l’estimation du nombre de copies
d’ADN cible.
Des recommandations d’ordre pratique pour la détermination de la LOD , expérimentale, figurent à
95 %
l’Annexe B.
L’Annexe C donne les principes fondamentaux du modèle statistique spécifique adapté aux méthodes de PCR.
5.3 Détermination du nombre de copies de séquences cibles d’ADN dans les matériaux
d’essai d’ADN
La validation nécessite la détermination du nombre de copies de séquences cibles d’ADN.
Le nombre de copies de la séquence cible pour une masse spécifiée d’acide nucléique (ADN) peut être calculé
à partir des équivalents génome haploïde utilisant la concentration d’ADN mesurée (voir l’ISO 21571:2005,
[9][10][11]
Annexe B) et la masse du génome . L’utilisation d’un équipement de PCR digitale (comme la PCR
digitale en gouttelettes) est une autre approche qui permet de déterminer avec précision le nombre de copies
[12]
d’une séquence cible d’ADN ou la concentration d’une solution d’ADN .
La qualité et la concentration (très élevées ou très faibles) de l’ADN d’arrière-plan utilisé pour la dilution
peuvent influencer l’expérience de validation. Il est donc vivement recommandé d’utiliser de l’ADN
permettant d’évaluer l’absence d’inhibiteurs de PCR (par exemple des préparations d’ADN de qualité biologie
[13]
moléculaire du commerce) et une concentration adaptée à l’ADN extrait des échantillons .
5.4 Évaluation des données relatives à la limite de détection
Il convient de déterminer la LOD , la courbe de POD moyenne et l’intervalle de confiance à 95 % à l’aide
95 %
d’un modèle statistique.
Le travail expérimental qui comprend également une composante de Poisson est fondé sur le modèle mixte
linéaire généralisé (MMLG) avec fonction de lien log-log complémentaire. Ce modèle s’est révélé être le plus
efficace lorsque le nombre de copies d’ADN est faible et suit une distribution de Poisson.
L’Annexe C donne des informations sur le MMLG avec fonction de lien log-log complémentaire. Pour ce calcul,
le nombre de copies nominales ajoutées à la réaction PCR, le nombre de réplicats réalisés et le nombre de
résultats positifs obtenus sont requis.
À partir des résultats de la série de dilution, la LOD , l’intervalle de confiance à 95 % et la courbe de
95 %
POD moyenne avec l’intervalle de confiance à 95 % correspondant peuvent être calculés à l’aide d’un service
[14] [15]
web ou du package R POD (voir l’Article C.5 ).
Vérifier que la LOD est plausible. Une valeur inférieure à 2,996 indique que le nombre de copies de la
95 %
séquence cible qui ont été réellement ajoutées à la réaction PCR ne correspondait pas au nombre (nominal)
[7]
estimé de copies pour les solutions d’ADN .
Si plus de deux résultats sont positifs au niveau correspondant à 0,1 copie de la séquence cible par PCR,
les dilutions d’ADN ne peuvent pas être considérées comme étant vérifiées et le nombre de copies doit être
réexaminé.
NOTE 1 Le calcul de la LOD n’est valide que si les faux positifs sont négligeables, c’est-à-dire si l’essai de
95 %
spécificité a réussi et si la contamination de PCR précédentes peut être exclue.
NOTE 2 Le niveau qui est le résultat d’une dilution décimale d’une copie nominale est appelé «niveau correspondant
à 0,1 copie par PCR» pour faciliter la lecture du présent document.
5.5 Efficacité de la PCR et variabilité du nombre mesuré de copies autour de la limite de
détection
Pour la détermination facultative de la variabilité du nombre de copies autour de la LOD , assigner le
95 %
nombre de copies aux valeurs Cq respectives sur la base d’une série d’étalonnage supplémentaire de l’ADN
cible (pour la préparation d’une série d’étalonnage, voir l’Article B.2).
Il convient d’évaluer la variabilité du nombre mesuré de copies autour de la LOD en comparant les écarts-
95 %
types de répétabilité avec les valeurs théoriques du modèle de Poisson. Un écart-type ajusté supérieur à
30 % indique que la LOD qui peut être obtenue lors d’une analyse de routine peut faire l’objet d’une
95 %
variabilité élevée (voir l’Article B.5).
Les données expérimentales recueillies permettent également de déterminer l’efficacité de la PCR
(voir l’Article B.6), la pente de la courbe d’amplification et le coefficient de détermination (R ). Une PCR
exempte d’influences inhibitrices amplifie en doublant de manière exponentielle avec une pente (Cq/nombre
de copies initiales) de −3,321 9. Il convient qu’une efficacité acceptable de la PCR ne s’écarte pas de plus
de ±10 % de la valeur théorique de 100 % (ce qui correspond à une pente dans l’intervalle de −3,1 à −3,6).
Lorsque l’efficacité de la PCR se révèle être supérieure au maximum théorique, il convient d’envisager la
présence d’erreurs dues à la configuration de la réaction et à l’inhibition de la PCR. Il convient que le
coefficient de détermination soit au moins de 0,98 (ou 98 %).
5.6 Spécificité
5.6.1 Généralités
Les résultats de l’analyse in silico et les résultats expérimentaux des essais réalisés sur la méthode avec les
bases de données de séquences génomiques et le matériau contenant la séquence cible doivent être fournis.
S’ils sont disponibles, il convient de réaliser des essais d’inclusivité et d’exclusivité en utilisant des données
et matériaux pertinents et représentatifs en fonction du domaine d’application de la méthode.
5.6.2 Essai bioinformatique (in silico) de spécificité
Des essais bioinformatiques de spécificité doivent être effectués en examinant les séquences d’oligonucléotides
et d’amplicons à l’aide d’outils bioinformatiques disponibles (par exemple la formation d’amorces-dimères
[16]
avec l’outil Primer 3 . L’homologie à d’autres séquences doit être examinée par des recherches dans des
®1)[17]
bases de données de séquences d’acides nucléiques (comme BLAST dans GenBank ).
Il convient que l’analyse in silico ne révèle aucune similitude entre la séquence cible et les séquences pouvant
être présentes dans l’échantillon, ce qui pourrait influer sur le résultat analytique. Il convient d’adapter la
ou les séquences d’oligonucléotides en conséquence, le cas échéant. Des recommandations complémentaires
relatives à l’analyse in silico se trouvent dans la Référence [18].
5.6.3 Essai pratique de spécificité
Effectuer des essais de réactions croisées inattendues avec l’ADN non cible. Contrôler la réactivité croisée
du système de détection PCR avec l’ADN d’organismes ayant des éléments génétiques, des gènes ou des
constructions génétiques similaires (homologues). Contrôler également les espèces qui sont souvent
présentes dans les aliments sous forme d’ingrédients (par exemple le maïs, le soja, le colza, le riz, la pomme
de terre, le blé, le bœuf, le poulet, le porc, le mouton, la dinde, le cheval).
Si l’ADN non cible est soumis à essai et qu’un résultat négatif est attendu, il convient d’ajouter au moins
2 500 copies à la réaction PCR. Si aucun matériau de référence présentant des concentrations suffisamment
élevées d’ADN non cible n’est disponible, des concentrations plus faibles peuvent être utilisées et il convient
d’indiquer le nombre de copies ajoutées. Vérifier l’aptitude à l’amplification de l’ADN non cible à l’aide d’un
essai indépendant.
Effectuer les essais avec l’ADN cible. Ajouter l’ADN cible pour lequel un résultat positif est attendu en nombre
de copies dans la plage de la limite de quantification (LOQ) (de manière empirique, le nombre de copies pour
la LOD peut être multiplié par un facteur de 3, c’est-à-dire en général 20 à 60 copies par PCR). Ajouter
95 %
l’ADN non cible à une concentration de 100 ng/25 µl à 200 ng/25 µl de mélange pour PCR à l’ADN cible, afin
de reproduire les conditions qui sont pertinentes dans la pratique et susceptibles d’influer sur le résultat.
Il suffit d’effectuer en double chacun des essais PCR d’inclusivité (en utilisant l’ADN cible) et d’exclusivité
(en utilisant l’ADN non cible).
Il convient que les résultats de la PCR pour les analyses in silico et les analyses expérimentales satisfassent
aux exigences et critères de la méthode ou les dépassent.
S’il existe une réactivité croisée qui est considérée comme étant acceptable, il faut l’indiquer et en tenir
compte dans le domaine d’application de la méthode.
5.6.4 Robustesse
La robustesse d’une méthode de PCR qualitative en temps réel doit être évaluée. L’évaluation de la robustesse
doit inclure des variations faibles mais délibérées, appliquées par exemple aux paramètres suivants de la
méthode:
— différents types d’équipement de PCR en temps réel, le cas échéant;
— kits de réactifs PCR;
— température d’hybridation appliquée au programme de cycles thermiques;
— volume de mélange maître;
— concentrations d’amorces et de sondes.
Un exemple réalisable de facteurs et de modifications appliqués aux conditions opératoires qui couvre tous
les aspects pertinents de la PCR qualitative en temps réel est donné dans le Tableau 1. D’autres facteurs ou
modifications peuvent être appliqués si leur ajout permet un gain d’une valeur informative suffisante.
1) BLAST dans GenBank® est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi
désigné.
[19]
Il convient d’effectuer les essais dans un plan d’expérience multifactoriel . Il convient que les réactions
PCR avec les différentes combinaisons de facteurs soient effectuées avec l’ADN cible à une concentration
proche du nombre de copies correspondant à la LOD multiplié par un facteur de 3 (correspondant à
95 %
environ 20 à 60 copies par PCR). Diluer l’ADN cible dans l’ADN non cible (ADN d’arrière-plan), par exemple
20 ng/µl. Pour chaque combinaison facteur-niveau, il convient d’effectuer les essais PCR au moins trois fois.
Le Tableau D.1 donne un exemple de mode opératoire.
La méthode doit donner des résultats positifs pour toutes les combinaisons, malgré les conditions modifiées.
En cas de résultats négatifs, l’essai PCR pour les combinaisons correspondantes doit être répété. En cas de
résultats négatifs répétés, la méthode n’est pas suffisamment robuste et doit être optimisée.
Des écarts importants entre les valeurs Cq peuvent indiquer que la robustesse de la méthode est insuffisante.
Les Tableaux 1 et 2 décrivent de manière statistique des exemples prouvés d’essais de robustesse.
D’autres options peuvent être appliquées si elles produisent des résultats statistiquement prouvés
comparables. Si le laboratoire seul constitue la base pour une étude interlaboratoires, les essais à plusieurs
variables sont fortement recommandés (voir l’Annexe D).
Tableau 1 — Exemple d’essai de robustesse des facteurs et modifications appliqués au mode
opératoire et aux conditions des méthodes de PCR qualitative en temps réel
Facteur 1 0
Équipement de PCR A B
Mélange maître pour PCR X Y
Concentration d’amorces inchangée −30 %
Concentration de sondes inchangée −30 %
Volume de mélange réactionnel Volume spécifié de mélange réactionnel Volume spécifié de mélange réaction-
pour PCR (si le volume total est de pour PCR – 5 % (19 µl) nel pour PCR + 5 % (21 µl)
25 µl) + 5 µl d’ADN + 5 µl d’ADN
Température d’hybridation +1 °C −1 °C
Tableau 2 — Exemple d’essai de robustesse à l’aide d’un plan d’expérience orthogonal
Facteur Combinaison
1 2 3 4 5 6 7 8
Équipement de PCR 1 1 1 1 0 0 0 0
Mélange maître pour PCR 1 1 0 0 1 1 0 0
Concentration d’amorces 1 0 1 0 1 0 1 0
Concentration de sondes 1 0 0 1 0 1 1 0
Volume total de mélange réactionnel pour PCR 1 1 0 0 0 0 1 1
Température d’hybridation 1 0 1 0 0 1 0 1
Un plan d’expérience orthogonal est caractérisé par l’algorithme suivant: pour n’importe quelle paire de
facteurs (par exemple, kit de PCR/concentration d’amorces), les quatre combinaisons facteur-niveau
(1+1, 1+0, 0+1, 0+0) existent avec la même fréquence (deux fois chacune) (voir le Tableau 2). Ce plan permet
de détecter les éventuels effets d’interaction factorielle sur les résultats de l’essai PCR.
6 Rapport de validation
Les informations concernant les résultats et les données obtenus lors de la validation intralaboratoire des
caractéristiques de performance doivent être documentées dans un rapport.
Le rapport doit contenir des informations sur les éléments suivants:
a) LOD :
95 %
1) espèce de l’ADN cible;
2) mode d’évaluation du nombre de copies pour les essais de sensibilité;
3) LOD estimée;
95 %
4) type et quantité d’ADN d’arrière-plan utilisé;
b) essais bioinformatiques de spécificité:
1) résultats;
2) base de données utilisée;
3) date à laquelle la base de données a été évaluée;
c) essais pratiques de spécificité:
1) espèce dont a été extrait l’ADN;
2) quantité utilisée par réaction;
3) résultats;
4) type et quantité d’ADN d’arrière-plan;
d) robustesse:
1) espèce dont a été extrait l’ADN;
2) quantité d’ADN par réaction;
3) modifications de paramètres;
4) résultats.
Annexe A
(informative)
Estimation du nombre de copies de la séquence cible d’ADN
A.1 Généralités
Le nombre théo
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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