ISO 13629-1:2012
(Main)Textiles — Determination of antifungal activity of textile products — Part 1: Luminescence method
Textiles — Determination of antifungal activity of textile products — Part 1: Luminescence method
ISO 13629-1:2012 specifies a test method for the quantitative determination of the antifungal activity by measuring the intensity of luminescence produced by an enzymatic reaction [adenosine triphosphate (ATP) method]. ISO 13629-1:2012 is applicable to various kinds of textile products, such as fibres, yarns, fabrics, clothing, bedclothes, home furnishings and other miscellaneous goods.
Textiles — Détermination de l'activité antifongique des produits textiles — Partie 1: Méthode par luminescence
L'ISO 13629-1:2012 spécifie une méthode d'essai pour la détermination quantitative de l'activité antifongique en mesurant l'intensité de la luminescence produite par une réaction enzymatique [méthode de l'ATP (adénosine triphosphate)]. L'ISO 13629-1:2012 s'applique aux différents types de produits textiles, tels que les fibres, les fils, les étoffes, les vêtements, les couvertures et les draps, les tissus d'ameublement et divers autres types d'articles.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13629-1
First edition
2012-08-15
Textiles — Determination of antifungal
activity of textile products —
Part 1:
Luminescence method
Textiles — Détermination de l’activité antifongique des produits textiles —
Partie 1: Méthode par luminescence
Reference number
©
ISO 2012
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Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative reference . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Safety precaution . 2
6 Reference fungi . 2
7 Apparatus . 2
8 Reagents and culture media . 3
8.1 General . 3
8.2 Pure water . 4
8.3 Anionic surfactant . 4
8.4 Luminescent reagents, reagents and buffer solutions . 4
8.5 Culture medium . 5
9 Fungus preservation and use . 6
9.1 Fungus preservation . 6
9.2 Use of fungus . 7
10 Spore suspension . 7
10.1 Suspending spores in culture media . 8
10.2 Collection and dispersion of spore suspension from a culture medium . 8
10.3 Filtering to remove hyphae and spore threads . 8
10.4 Using centrifugal separation and resuspension to remove supernatant . 8
10.5 Confirming the concentration of spore suspension . 9
10.6 Adjusting spore suspension for testing. 9
11 Preparing the ATP calibration curve . 9
12 Testing method .10
12.1 Preparation of test specimens and inoculation .10
12.2 Incubation .12
13 Measurement of luminescence intensity .12
13.1 Absorption method .12
13.2 Transfer method .13
14 Calculation .14
14.1 Judgment of test effectiveness .14
14.2 Calculation of antifungal activity value .14
15 Test report .15
Annex A (normative) The fungi used in this part of ISO 13629 .16
Annex B (informative) Antifungal efficacy .17
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13629-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles.
ISO 13629 consists of the following parts, under the general title Textiles — Determination of antifungal activity
of textile products:
— Part 1: Luminescence method
— Part 2: Plate count method (under preparation)
iv © ISO 2012 – All rights reserved
Introduction
Speciality products of antimicrobial-treated textiles have been increasing year by year in various applications
and they certainly contribute to the prevention of a material’s deterioration and to the improvement of the
environment and quality of life.
For these reasons, ISO/TC 38/WG 23 developed ISO 20743 in 2007, and is continuing to study a test method
on the antifungal activity of textile products for a series of International Standards.
This part of ISO 13629 adopts an ATP luminescence method as a basis for the quantitative determination of
antifungal activity.
Characteristics of the luminescence method are as follows:
— extremely small margin of error compared to the colony count method;
— elimination of the culturing time for colony formation, enabling a shorter testing time;
— simplification of testing operation.
The other parts will be developed relating to:
— Part 2: Plate count method.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13629-1:2012(E)
Textiles — Determination of antifungal activity of textile
products —
Part 1:
Luminescence method
1 Scope
This part of ISO 13629 specifies a test method for the quantitative determination of the antifungal activity by measuring
the intensity of luminescence produced by an enzymatic reaction [adenosine triphosphate (ATP) method].
The part of ISO 13629 is applicable to various kinds of textile products, such as fibres, yarns, fabrics, clothing,
bedclothes, home furnishings and other miscellaneous goods.
Based on the intended application and on the environment in which the textile product is to be used, the user can
select the most suitable evaluation method from the following methods before enumeration by the ATP method:
a) absorption method (an evaluation method in which test fungi suspension is inoculated directly onto
the specimens);
b) transfer method (an evaluation method in which test fungi are placed on an agar plate and printed onto
the specimens).
2 Normative reference
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 105-F02, Textiles — Tests for colour fastness —Part F02: Specification for cotton and viscose adjacent fabrics
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
control specimen
specimen used to validate the growth condition of test fungus
NOTE The control specimen may be taken from the same textile products as the textile products to be tested, but
without antifungal treatment. If this is not available, a 100 % cotton specimen without fluorescent brighteners or other finish,
complying with the requirements of ISO 105-F02, is used as the control specimen, after 10 cycles of washing for 10 min at
a temperature of 60 °C without detergents or any brighteners and rinsing twice for 5 min in accordance with ISO 6330.
3.2
antifungal agent
agent to prevent or mitigate the growth of fungus or to reduce the number of fungus
3.3
antifungal treatment
treatment to prevent or mitigate the growth of fungus or to reduce the number of fungus
3.4
spore suspension
liquid with evenly dispersed fungal spores in sterilized water containing an anionic surfactant (8.3)
3.5
ATP
adenosine triphosphate, a multifunctional nucleotide present in living fungi
3.6
antifungal activity
activity to prevent or mitigate the growth of fungus, expressed as the difference of growth value in logarithm of
ATP between the control and test specimen
3.7
luminescence method
method in which the amount of ATP contained in fungal cells is measured in moles of ATP
4 Principle
A test specimen and control specimen are inoculated with a spore suspension of a reference fungus and
incubated at 25 °C for 42 h.
In this part of ISO 13629, fungal growth or antifungal activity is determined quantitatively, by comparison with
the result of a control specimen, by measuring the luminescence intensity of intracellular ATP.
5 Safety precaution
The test methods specified herein require the use of fungus.
This test shall be performed only by personnel with training and experience in microbiological techniques.
All regulations, rules and recommendations regarding appropriate safety precautions in the country concerned
shall be consulted and followed.
6 Reference fungi
The fungi to be used shall be selected from Table A.1.
Equivalent fungi types obtained from other agencies of the World Federation for Culture Collection (WFCC)
may be used as agreed upon between the interested parties.
The preservation number and supply source of the fungus used shall be stated in the test report.
7 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
7.1 Gauze, for biochemical testing or glass wool (FR specification).
7.2 Petri dishes, with internal diameters of approximately 90 mm and 55 mm to 60 mm.
7.3 Dry sterilizer, capable of maintaining the temperature at 160 °C to 180 °C.
7.4 Autoclave, capable of maintaining the temperature at (121 ± 2 ) °C (equivalent to 103 kPa).
7.5 Safety cabinet, for biochemical testing, or one that offers equivalent performance.
2 © ISO 2012 – All rights reserved
7.6 Platinum colony loop, with a loop of 2 mm to 4 mm in diameter.
7.7 L-shaped platinum colony hook.
7.8 Incubator, capable of maintaining the target temperature range of 20 °C to 37 °C with a margin of ± 2 °C.
7.9 Vial, 30 ml screw-top glass vial with polytetrafluoroethylene or silicone gasket and polypropylene cap.
7.10 Glass rod, between 5 mm and 18 mm in diameter and 1 g to 50 g in mass.
7.11 Glass funnel.
7.12 Pipettes, of capacity 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml,1 ml, 5 ml and 10 ml with a tolerance of 5,0 %.
7.13 Pasteur pipette, for microbiological testing.
7.14 Conical flask, of capacity 100 ml to 500 ml.
7.15 Tweezers.
7.16 Plastic test tube, especially for the luminometer.
7.17 Test-tube agitator.
7.18 Centrifugal separator, with a centrifugal acceleration of approximately 2 000g.
7.19 Centrifuge tube, used in a centrifugal separator.
6 6
7.20 Hemocytometer, capable of measuring 1 × 10 /ml to 3 × 10 /ml.
7.21 Microscope, magnification 200×.
7.22 Ultrasonic cleaner, compact, for experimental tools, with a frequency of approximately 30 kHz to 50 kHz.
7.23 Luminometer, measuring at a wavelength of 300 nm to 650 nm, and capable of ATP measurement at
–8 –5
1 × 10 mol/l to 1 × 10 mol/l, under the assay conditions defined in 8.4 and Clause 11.
7.24 pH-meter, with an accuracy of ± 0,1 at 25 °C.
7.25 Refrigerator, capable of maintaining a temperature of between 2 °C and 10 °C.
7.26 Freezers, one adjustable to a temperature below - 80 °C and another to a temperature below - 20 °C.
Test tubes, vials, flasks, pipettes and tweezers shall be carefully washed in alkaline or neutral detergent,
rinsed, dried, and processed by dry sterilization or high-pressure steam sterilization before use.
8 Reagents and culture media
8.1 General
Reagents used in tests shall be of analytical quality and/or suitable for microbiological purposes.
Dehydrated products available on the commercial market are recommended for use in preparing the culture
media, strictly in accordance with the manufacture’s instructions.
8.2 Pure water
Analytical-grade water for microbiological media and reagent preparation, which is freshly distilled and/or
ion-exchanged and/or ultra-filtered and/or filtered with reverse osmosis (RO). It shall be free from all toxic or
fungus-inhibitory substances.
8.3 Anionic surfactant
Dioctyl sodium sulfosuccinate to prepare the spore suspension.
8.4 Luminescent reagents, reagents and buffer solutions
8.4.1 General
Use reagents and buffer solutions prepared as shown in 8.4.2 to 8.4.8. Commercially prepared items may be
used after appropriate validation.
-3
8.4.2 ATP standard stock solution (1 × 10 mol/l) referred to as ATP standard hereafter
Adenosine-disodium 5’-triphosphate trihydrate 60,5 mg
(C H O P Na ·3H O)
10 14 13 3 2 2
Pure water (8.2) 100 ml (final volume)
Place the prepared solution in a tightly sealed container and freeze at a temperature of - 20 °C or lower for
storage of up to 6 months.
NOTE It is not recommended to refreeze and/or reuse a melted solution.
8.4.3 Buffer solution for ATP luminescent reagent
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl] glycine 1 117 mg
Disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate 183 mg
Magnesium acetate tetrahydrate 808 mg
DL-dithiothreitol 6,7 mg
Dextrin 25 000 mg
Sucrose 925 mg
Pure water 250 ml (final volume)
pH 7,5 ± 0,2
8.4.4 ATP luminescent reagent
-8
ATP luminescent reagents shall enable a luminometer (7.23) to measure the ATP of 1 × 10 mol/l to
-5
1 × 10 mol/l, under the assay conditions defined in 8.4 and Clause 11.
Luciferase 0,7 mg
D-luciferin 12,6 mg
4 © ISO 2012 – All rights reserved
Bovine serum albumin 56 mg
Buffer solution (see 8.4.3) 30 ml
Once fully dissolved, stand at room temperature for 15 min before use. Use within 3 h of preparation.
8.4.5 ATP extraction reagent
ATP extraction reagents must be able to extract intracellular ATP from the incubated fungus with an efficiency
of 80 % or higher.
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl] glycine 45 mg
Benzalkonium chloride, 10 % aqueous solution 0,2 ml
Pure water 9,8 ml
pH (use sodium hydroxide to adjust pH) 12,0 ± 0,5
The use of any unspecified extracting agent in the composition shall be recorded.
8.4.6 ATP eliminating reagent
-11
ATP eliminating reagents shall reduce the culture medium ATP content to less than 10 mol/l within 15 min
when one-tenth of the reagent in quantity is added to the culture medium (defined in 8.5.1).
Use within 8 h of preparation.
The composition is as follows:
Apyrase (EC: 3.6.1.5) 4,6 international units/ml
Adenosine phosphate deaminase (EC: 3.5.4.6 or 3.5.4.17) 46 international units/ml
Sucrose 37 mg
Bovine serum albumin 20 mg
0,05 mol/l buffer solution of 2-morpholinoethanesulfonic acid, 10 ml
monohydrate
pH 6,0 ± 0,5
When a different eliminating reagent is used, its composition shall be recorded.
8.4.7 Physiological saline solution
Place 8,5 g of sodium chloride in 1 000 ml of pure water in a flask. Thoroughly dissolve and pour it into test
tubes as needed for steam pressure sterilization.
8.4.8 Sterilized water containing anionic surfactant (8.3)
Dissolve 50 mg of anionic surfactant in pure water and make up to 1 000 ml, then pour it into test tubes as
needed for high-pressure steam sterilization.
8.5 Culture medium
Use a culture medium prepared as described in 8.5.1 to 8.5.4. Commercially prepared items may be used after
appropriate validation.
For culture media that will not be used immediately after preparation, it is recommended that they be stored at
5 °C to 10 °C and discarded after one month.
8.5.1 Sabouraud dextrose broth (SDB)
Peptone 10 g
Dextrose 20 g to 40 g
Pure water 1 000 ml
pH after sterilization 5,6 ± 0,2
8.5.2 Potato dextrose agar (PDA)
Wash and peel a large potato with minimal blemishes, removing approximately 10 mm around each bud, and
dice it into 10 mm cubes. Boil 200 g of these cubes in 1 000 ml of pure water for 1 h. Use several layers of
gauze (7.1) to drain, then add distilled water so that the volume of the mixture equals 1 000 ml. Add 20 g of
glucose and 15 g to 20 g of agar, fully dissolving the solids before placing in the autoclave (7.4) for sterilization.
8.5.3 Slant culture
Pour approximately 10 ml of preheated and fully dissolved PDA (described in 8.5.2) into a test tube. Stopper
with a cotton plug and sterilize with steam. After sterilization, place the test tube at an approximately 15° angle
against a level surface on a clean laboratory table, and leave the contents to solidify. When there is no bleed
water on the solidified agar, dissolve and solidify it again for use.
8.5.4 Sabouraud dextrose agar (SDA)
Pepsic meat pepton 10 g
Dextrose 35 g
Agar 15 g
Pure water 1 000 ml (final volume)
Follow the indications of the supplier.
pH after sterilization 5,6 ± 0,2
NOTE This medium will be used for the transfer method.
9 Fungus preservation and use
9.1 Fungus preservation
Reference fungi and spores are subcultured and handled inside a safety cabinet (7.5) or other equivalent system.
— Conduct either flame sterilization or the chemical sterilization on the cotton plugs and necks of the test
tubes before and after subculture.
— Scrape off a small amount of fungus from the original fungus, spread the spores over the bleed water at
the bottom of the slant culture and smear onto the top end of the slant culture, in either a straight or wavy
line (see Figure 1).
— Use the flame-sterilized platinum colony loop (7.6) and hook (7.7) each time when different types of fungus
are subcultured.
— Place the subcultured slant cultures in an incubator (7.8) at 25 °C ± 2 °C for at least 8 days, and confirm
that sufficient spores have been generated before preserving them at 5 °C to 10 °C.
— Within 3 months, transplant the subcultured fungus to new slant cultures for further incubation and
preservation.
6 © ISO 2012 – All rights reserved
— Repeat the subculture at intervals of up to 3 months. The passage culture, however, shall not be subcultured
more than five times. Do not use fungus over 3 months old for further subculture.
NOTE Long-term preservation can be possible by freeze-drying at -80 °C.
Key
1 bleed water
2 slant culture
Figure 1 — Subculture to a slant culture
9.2 Use of fungus
To prepare the fungus for spore suspension, as described in Clause 10, transplant the fungus preserved in 9.1
onto a plate culture, incubating at 25 °C ± 2 °C for at least 8 days. When the fungus is not used imm
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 13629-1
Première édition
2012-08-15
Textiles — Détermination de l’activité
antifongique des produits textiles —
Partie 1:
Méthode par luminescence
Textiles — Determination of antifungal activity of textile products —
Part 1: Luminescence method
Numéro de référence
©
ISO 2012
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit
de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
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Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Mesures de sécurité . 2
6 Champignons de référence . 2
7 Appareillage . 2
8 Réactifs et milieux de culture . 4
8.1 Généralités . 4
8.2 Eau pure . 4
8.3 Tensio-actif anionique . 4
8.4 Réactifs luminescents, réactifs et solutions tampons . 4
8.5 Milieu de culture . 6
9 Conservation et utilisation du champignon . 7
9.1 Conservation du champignon. 7
9.2 Utilisation du champignon . 7
10 Suspension de spores . 7
10.1 Suspension de spores dans des milieux de culture . 8
10.2 Collecte et dispersion de la suspension de spores à partir d’un milieu de culture . 8
10.3 Filtration pour éliminer les hyphes et les filaments de spore . 8
10.4 Utilisation de la séparation centrifuge et re-suspension pour éliminer le liquide surnageant . 9
10.5 Confirmation de la concentration de la suspension de spores . 9
10.6 Ajustement de la suspension de spores pour les essais . 9
11 Préparation de la courbe d’étalonnage de l’ATP . 9
12 Méthode d’essai .10
12.1 Préparation des éprouvettes et inoculation .10
12.2 Incubation .12
13 Mesurage de l’intensité de la luminescence .13
13.1 Méthode d’absorption .13
13.2 Méthode de transfert .14
14 Calcul .14
14.1 Évaluation de l’efficacité de l’essai .14
14.2 Calcul de la valeur d’activité antifongique .14
15 Rapport d’essai .15
Annexe A (normative) Champignons utilisés dans la présente partie de l’ISO 13629 .16
Annexe B (informative) Efficacité antifongique .17
Bibliographie .18
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 13629-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 38, Textiles.
L’ISO 13629 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Textiles — Détermination de
l’activité antifongique des produits textiles:
— Partie 1: Méthode par luminescence
La partie suivante est en cours d’élaboration:
— Partie 2: Méthode par dénombrement sur plaque de gélose
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
Introduction
L’utilisation de produits spécialisés dans les textiles antimicrobiens se développe d’année en année pour
diverses applications. Ces produits contribuent certainement à la prévention de la détérioration des matériaux
et à l’amélioration de l’environnement et de la qualité de vie.
Pour ces raisons, l’ISO/TC 38/GT 23 a élaboré l’ISO 20743 en 2007 et continue à étudier une méthode d’essai
portant sur l’activité antifongique des produits textiles sous la forme d’une série de Normes internationales.
La présente partie de l’ISO 13629 adopte une méthode par luminescence de l’ATP (adénosine triphosphate)
comme base pour la détermination quantitative de l’activité antifongique.
Les caractéristiques de la méthode par luminescence sont les suivantes:
— marge d’erreur extrêmement faible comparativement à la méthode par dénombrement de colonies;
— élimination du temps de culture pour la formation des colonies et, par conséquent, obtention d’un temps
d’essai plus court;
— simplification du déroulement de l’essai.
NORME INTERNATIONALE ISO 13629-1:2012(F)
Textiles — Détermination de l’activité antifongique
des produits textiles —
Partie 1:
Méthode par luminescence
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 13629 spécifie une méthode d’essai pour la détermination quantitative de l’activité
antifongique en mesurant l’intensité de la luminescence produite par une réaction enzymatique [méthode de
l’ATP (adénosine triphosphate)].
La présente partie de l’ISO 13629 s’applique aux différents types de produits textiles, tels que les fibres, les fils,
les étoffes, les vêtements, les couvertures et les draps, les tissus d’ameublement et divers autres types d’articles.
En fonction de l’application prévue et de l’environnement dans lequel le produit textile est utilisé, l’utilisateur
peut choisir la méthode d’évaluation qui convient le mieux parmi les suivantes, avant le dénombrement avec
la méthode de l’ATP:
a) la méthode d’absorption (méthode d’évaluation dans laquelle la suspension de champignons d’essai est
inoculée directement sur les éprouvettes);
b) la méthode de transfert (méthode d’évaluation dans laquelle les champignons d’essai sont placés sur une
boîte de gélose avant d’être imprimés sur les éprouvettes).
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 105-F02, Textiles — Essais de solidité des teintures — Partie F02: Spécifications pour les tissus témoins
en coton et en viscose
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
éprouvette témoin
éprouvette utilisée pour confirmer la croissance du champignon d’essai
NOTE L’éprouvette témoin peut être issue des mêmes produits textiles que ceux soumis à essai mais sans traitement
antifongique. Si une telle éprouvette n’est pas disponible, une éprouvette 100 % coton sans azurant optique ou autre
apprêt, conforme aux exigences de l’ISO 105-F02, est utilisée comme éprouvette témoin après 10 cycles de lavage de
10 min à une température de 60 °C sans détergents ni azurants et un double rinçage de 5 min conformément à l’ISO 6330.
3.2
agent antifongique
agent servant à empêcher ou à atténuer la croissance de champignons ou à réduire leur nombre
3.3
traitement antifongique
traitement servant à empêcher ou à atténuer la croissance de champignons ou à réduire leur nombre
3.4
suspension de spores
liquide contenant des spores fongiques uniformément réparties dans de l’eau stérilisée contenant un tensio-
actif anionique (8.3)
3.5
ATP
adénosine triphosphate, nucléotide multifonctionnel présent dans les champignons vivants
3.6
activité antifongique
activité servant à empêcher ou à atténuer la croissance de champignons, exprimée sous forme de différence
de la valeur de croissance en logarithme de l’ATP entre l’éprouvette témoin et l’éprouvette d’essai
3.7
méthode par luminescence
méthode dans laquelle la quantité d’ATP contenue dans les cellules fongiques est mesurée en moles d’ATP
4 Principe
Une éprouvette d’essai et une éprouvette témoin sont inoculées avec une suspension de spores d’un
champignon de référence et incubées à 25 °C pendant 42 h.
Dans la présente partie de l’ISO 13629, la croissance fongique ou l’activité antifongique sont déterminées
de manière quantitative, par comparaison avec le résultat obtenu avec une éprouvette témoin, en mesurant
l’intensité de la luminescence de l’ATP intracellulaire.
5 Mesures de sécurité
Les méthodes d’essai spécifiées ici nécessitent l’utilisation de champignons.
Cet essai doit être réalisé exclusivement par un personnel ayant reçu une formation et ayant de l’expérience
dans les techniques microbiologiques.
Toutes les réglementations, règles et recommandations concernant les mesures de sécurité à prendre dans le
pays concerné doivent être consultées et suivies.
6 Champignons de référence
Les champignons à utiliser doivent être choisis dans le Tableau A.1.
Des types de champignons équivalents obtenus auprès d’autres agences de la Fédération mondiale des
collections de cultures (World Federation for Culture Collections — WFCC) peuvent être utilisés sous réserve
d’un accord entre les parties intéressées.
Le numéro de conservation et la provenance de la souche du champignon utilisé doivent être mentionnés dans
le rapport d’essai.
7 Appareillage
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Gaze, pour les essais biochimiques ou laine de verre (spécification FR).
7.2 Boîtes de Petri, d’un diamètre intérieur d’environ 90 mm et de 55 mm à 60 mm.
7.3 Stérilisateur à sec, pouvant maintenir la température entre 160 °C et 180 °C.
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7.4 Autoclave, pouvant maintenir la température à (121 ± 2) °C (équivalent à 103 kPa).
7.5 Poste de sécurité microbiologique, pour les essais biochimiques ou offrant des performances
équivalentes.
7.6 Anse d’ensemencement en platine, de 2 mm à 4 mm de diamètre.
7.7 Fil d’ensemencement en platine en forme de L.
7.8 Incubateur, pouvant maintenir la température cible dans une plage comprise entre 20 °C et 37 °C avec
une tolérance de ± 2 °C.
7.9 Flacon, à bouchon à vis de 30 ml en verre, avec un joint en polytétrafluoroéthylène ou en silicone et un
bouchon en polypropylène.
7.10 Baguette de verre, d’un diamètre compris entre 5 mm et 18 mm et d’une masse comprise entre 1 g et 50 g.
7.11 Entonnoir en verre.
7.12 Pipettes, d’une capacité de 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml, 1 ml, 5 ml et 10 ml avec une tolérance de 5,0 %.
7.13 Pipette Pasteur, pour les essais microbiologiques.
7.14 Fiole conique, d’une capacité comprise entre 100 ml et 500 ml.
7.15 Pinces.
7.16 Tube à essai en plastique, spécialement conçu pour le luminomètre.
7.17 Agitateur pour tubes à essai.
7.18 Séparateur centrifuge, ayant une accélération centrifuge d’environ 2 000g.
7.19 Tube à centrifuger, utilisé dans un séparateur centrifuge.
6 6
7.20 Hématimètre, permettant de réaliser des mesures entre 1 × 10 /ml et 3 × 10 /ml.
7.21 Microscope, d’un grossissement ×200.
7.22 Nettoyeur à ultrasons, compact, pour les outils d’expérimentation, ayant une fréquence d’environ
30 kHz à 50 kHz.
7.23 Luminomètre, mesurant à une longueur d’onde comprise entre 300 nm et 650 nm, et permettant de
–8 –5
réaliser des mesures de l’ATP entre 1 × 10 mol/l et 1 × 10 mol/l, dans les conditions d’essai définies en 8.4
et à l’Article 11.
7.24 pH-mètre, d’une précision de ± 0,1 à 25 °C.
7.25 Réfrigérateur, pouvant maintenir la température entre 2 °C et 10 °C.
7.26 Deux congélateurs, l’un étant réglable à une température inférieure à –80 °C et l’autre à une température
inférieure à –20 °C.
Les tubes à essai, flacons, fioles, pipettes et pinces, doivent être soigneusement lavés dans un détergent
alcalin ou neutre, rincés, séchés et traités par stérilisation à sec ou par stérilisation à la vapeur sous haute
pression avant utilisation.
8 Réactifs et milieux de culture
8.1 Généralités
Les réactifs utilisés lors des essais doivent être de qualité analytique et/ou adaptés pour les essais
microbiologiques.
Il est recommandé d’utiliser des produits déshydratés disponibles dans le commerce pour la préparation des
milieux de culture, en respectant scrupuleusement les instructions du fabricant.
8.2 Eau pure
Eau de qualité analytique pour la préparation des milieux microbiologiques et des réactifs, fraîchement distillée
et/ou passée sur résine échangeuse d’ions et/ou ultra-filtrée et/ou filtrée par osmose inverse (OI). Elle doit être
exempte de substances toxiques ou inhibitrices pour les champignons.
8.3 Tensio-actif anionique
Sulfosuccinate de dioctyle et de sodium pour préparer la suspension de spores.
8.4 Réactifs luminescents, réactifs et solutions tampons
8.4.1 Généralités
Utiliser des réactifs et des solutions tampons préparés comme indiqué en 8.4.2 à 8.4.8. Des produits préparés
du commerce peuvent être utilisés après une validation appropriée.
-3
8.4.2 Solution étalon mère d’ATP (1 × 10 mol/l) appelée «étalon ATP» ci-après
Adénosine-5′triphosphate disodique trihydraté 60,5 mg
(C H O P Na , 3H O)
10 14 13 3 2 2
Eau pure (8.2) 100 ml (volume final)
Placer la solution préparée dans un récipient hermétiquement fermé et congeler à une température de -20 °C
ou inférieure pour une conservation pendant 6 mois au maximum.
NOTE Il n’est pas recommandé de recongeler et/ou de réutiliser une solution ayant été décongelée.
8.4.3 Solution tampon pour réactif luminescent ATP
N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl] glycine 1 117 mg
Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique dihydraté 183 mg
Acétate de magnésium tétrahydraté 808 mg
DL-dithiothreitol 6,7 mg
Dextrine 25 000 mg
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Sucrose 925 mg
Eau pure 250 ml (volume final)
pH 7,5 ± 0,2
8.4.4 Réactif luminescent ATP
-8
Les réactifs luminescents ATP doivent permettre à un luminomètre (7.23) de mesurer l’ATP entre 1 × 10 mol/l
-5
et 1 × 10 mol/l, dans les conditions d’essai définies en 8.4 et à l’Article 11.
Luciférase 0,7 mg
D-luciférine 12,6 mg
Albumine de sérum bovin 56 mg
Solution tampon (voir 8.4.3) 30 ml
Après dissolution complète, laisser reposer à température ambiante pendant 15 min avant utilisation. Utiliser
dans les 3 h qui suivent la préparation.
8.4.5 Réactif d’extraction de l’ATP
Les réactifs d’extraction de l’ATP doivent permettre d’extraire l’ATP intracellulaire à partir du champignon
incubé avec une efficacité d’au moins 80 %.
N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl] glycine 45 mg
Chlorure de benzalkonium, solution aqueuse à 10 % 0,2 ml
Eau pure 9,8 ml
pH (utiliser de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH) 12,0 ± 0,5
L’utilisation de tout agent d’extraction non spécifié dans la composition doit être enregistrée.
8.4.6 Réactif d’élimination de l’ATP
-11
Les réactifs d’élimination de l’ATP doivent réduire la teneur en ATP du milieu de culture à moins de 10 mol/l
dans les 15 min lorsqu’un dixième du réactif en quantité est ajouté au milieu de culture (défini en 8.5.1).
Utiliser dans les 8 h qui suivent la préparation.
La composition est la suivante:
Apyrase (CE: 3.6.1.5) 4,6 unités internationales/ml
Désaminase d’adénosine phosphate (CE: 3.5.4.6 ou 3.5.4.17) 46 unités internationales/ml
Sucrose 37 mg
Albumine de sérum bovin 20 mg
Solution tampon à 0,05 mol/l 10 ml
d’acide 2-morpholinoéthanesufonique monohydraté
pH 6,0 ± 0,5
Lorsqu’un réactif d’élimination différent est utilisé, sa composition doit être enregistrée.
8.4.7 Solution saline physiologique
Placer 8,5 g de chlorure de sodium dans 1 000 ml d’eau pure dans une fiole. Dissoudre soigneusement et
transvaser dans des tubes à essai en fonction des besoins en vue de la stérilisation à la vapeur sous pression.
8.4.8 Eau stérilisée contenant un tensio-actif anionique (8.3)
Dissoudre 50 mg de tensio-actif anionique dans de l’eau pure et compléter à 1 000 ml, puis transvaser dans
des tubes à essai en fonction des besoins en vue de la stérilisation à la vapeur sous haute pression.
8.5 Milieu de culture
Utiliser un milieu de culture préparé comme décrit en 8.5.1 à 8.5.4. Des produits préparés du commerce
peuvent être utilisés après une validation appropriée.
Pour les milieux de culture qui ne sont pas utilisés immédiatement après leur préparation, il est recommandé
de les conserver à une température comprise entre 5 °C et 10 °C et de les jeter au bout d’un mois.
8.5.1 Bouillon de Sabouraud au dextrose (SDB)
Peptone 10 g
Dextrose 20 g à 40 g
Eau pure 1 000 ml
pH après stérilisation 5,6 ± 0,2
8.5.2 Gélose à la pomme de terre et au dextrose (PDA)
Laver et éplucher une grande pomme de terre avec le moins de défauts d’aspect possible, en retirant environ
10 mm autour de chaque bourgeon et couper en cubes de 10 mm. Faire bouillir 200 g de ces cubes dans
1 000 ml d’eau pure pendant 1 h. Utiliser plusieurs couches de gaze (7.1) pour égoutter, puis ajouter de l’eau
distillée de sorte que le volume du mélange soit égal à 1 000 ml. Ajouter 20 g de glucose et entre 15 g et 20 g
d’agar-agar, en attendant la dissolution complète des matières solides avant la mise en place dans l’autoclave
(7.4) pour la stérilisation.
8.5.3 Culture inclinée
Verser environ 10 ml de PDA préchauffée et entièrement dissoute (voir 8.5.2) dans un tube à essai. Boucher avec
un bouchon en coton et stériliser à la vapeur. Après la stérilisation, placer le tube à essai à un angle d’environ
15° contre une surface plane sur une table de laboratoire propre et laisser le contenu se solidifier. Lorsqu’il ne
reste plus d’eau en excédent sur la gélose solidifiée, dissoudre et solidifier à nouveau avant utilisation.
8.5.4 Gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)
Peptone pepsique de viande 10 g
Dextrose 35 g
Agar-agar 15 g
Eau pure 1 000 ml (volume final)
Suivre les indications du fournisseur.
pH après stérilisation 5,6 ± 0,2
NOTE Ce milieu est utilisé pour la méthode de transfert.
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9 Conservation et utilisation du champignon
9.1 Conservation du champignon
Les champignons et les spores de référence sont repiqués et traités dans un poste de sécurité microbiologique
(7.5) ou autre système équivalent.
— Réaliser une stérilisation à la flamme ou une stérilisation chimique sur les bouchons de coton et les cols
des tubes à essai avant et après le repiquage.
— Racler une petite quantité de champignon sur le champignon d’origine, étaler les spores sur l’eau en
excédent qui se trouve au fond de la culture inclinée et répartir en partant du sommet de la culture inclinée
soit en ligne droite, soit selon une ligne ondulée (voir la Figure 1).
— Utiliser l’anse (7.6) et le fil d’ensemencement en platine (7.7) stérilisés à la flamme à chaque fois que des
types de champignons différents sont repiqués.
— Placer les cultures inclinées repiquées dans un incubateur (7.8) à 25 °C ± 2 °C pendant au moins 8 jours
et vérifier qu’une quantité suffisante de spores a été produite avant la conservation entre 5 °C et 10 °C.
— Dans les 3 mois, transplanter le champignon repiqué vers de nouvelles cultures inclinées en vue d’une
nouvelle incubation et conservation.
— Répéter le repiquage à intervalles de 3 mois maximum. La culture ne doit toutefois pas être repiquée plus
de cinq fois. Ne pas utiliser de champignon de plus de 3 mois pour d’autres repiquages.
NOTE La conservation à long terme peut être possible par congélation à –80 °C.
Légende
1 eau en excédent
2 culture inclinée
Figure 1 — Repiquage sur une culture inclinée
9.2 Utilisation du champignon
Pour préparer le champignon pour la suspension de spores décrite à l’Article 10, transplanter le champignon
conservé en 9.1 sur une culture en boîte de Petri, en incubant à 25 °C ± 2 °C pendant au moins 8 jours. Lorsque
le champignon n’est pas utilisé immédiatement après incubation, le conserver entre 5 °C et 10 °C et l’utiliser
dans les 7 jours.
10 Suspension de spores
Voir la Figure 2.
Légende
1 pré-culture en boîte de Petri de PDA
2 Étape 1
3 Étape 2
4 Étape 3
5 Étape 4
6 Étape 5
Figure 2 — Étapes du mode opératoire pour l’ajustement
...
Questions, Comments and Discussion
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