ISO 17678:2019
(Main)Milk and milk products — Determination of milk fat purity by gas chromatographic analysis of triglycerides
Milk and milk products — Determination of milk fat purity by gas chromatographic analysis of triglycerides
This document specifies a reference method for the determination of milk fat purity using gas chromatographic analysis of triglycerides. The method utilizes the differences in triglyceride fingerprint of milk fat from the individual triglyceride fingerprints of other fats and oils to determine samples which are outside the range normally observed for milk fat. This is achieved by using the defined triglyceride formulae based on the normalized weighted sum of individual triglyceride peaks which are sensitive to the integrity of the milk[6][7]. The integrity of the milk fat can be determined by comparing the result of these formulae with those previously observed for a range of pure milk fat samples[12]. Both vegetable fats and animal fats such as beef tallow and lard can be detected. The method is applicable to bulk milk, or products made thereof, irrespective of the variation in common feeding practices, breed or lactation conditions. In particular, the method is applicable to fat extracted from milk products purporting to contain pure milk fat with unchanged composition, such as butter, cream, milk and milk powder. Because a false-positive result can occur, the method does not apply to milk fat related to these circumstances: a) obtained from bovine milk other than cow's milk; b) obtained from single cows; c) obtained from cows whose diet contained a particularly high proportion of vegetable oils such as rapeseed, cotton or palm oil, etc.; d) obtained from cows suffering from serious underfeeding (strong energy deficit); e) obtained from colostrum; f) subjected to technological treatment such as removal of cholesterol or fractionation; g) obtained from skim milk, buttermilk or whey; h) obtained from cheeses showing increased lipolysis; i) extracted using the Gerber, Weibull?Berntrop or Schmid?Bondzynski?Ratzlaff methods, or that has been isolated using detergents (e.g. the Bureau of Dairy Industries method). With the extraction methods specified in i), substantial quantities of partial glycerides or phospholipids can pass into the fat phase. NOTE 1 In nature, butyric (n-butanoic) acid (C4) occurs exclusively in milk fat and enables quantitative estimations of low to moderate amounts of milk fat in vegetable and animal fats to be made. Due to the large variation of C4, for which the approximate content ranges from 3,1 % fat mass fraction to 3,8 % fat mass fraction, it is difficult to provide qualitative and quantitative information for foreign fat to pure milk fat ratios of up to 20 % mass fraction[11]. NOTE 2 In practice, quantitative results cannot be derived from the sterol content of vegetable fats, because they depend on production and processing conditions. Furthermore, the qualitative determination of foreign fat using sterols is ambiguous. NOTE 3 Due to special feeding practices such as those related to c) and d), false-positive results have sometimes been reported for milk from certain Asian regions[15]. Moreover, grass-only diets such as mountain and, in particular, highland pasture feeding sometimes cause false-positive results, which can be substantiated by a content of conjugated linoleic acid (C18:2 c9t11) of ≥ 1,3 % fatty acid mass fraction[16][17]. Nevertheless, results conforming to the criteria of milk fat purity specified in this document are accepted, even if samples were undoubtedly produced under conditions reported in this note, including those described in h). NOTE 4 In cases where a positive result is suspected to be caused by circumstances related to c) or d), another analytical method, such as fatty acid or sterol analysis, can be applied to confirm the finding. Due to similar or increased limitations (e.g. as described in NOTE 1 and NOTE 2), a negative result obtained by another method is not appropriate to contrastingly confirm milk fat purity.
Lait et produits laitiers — Détermination de la pureté des matières grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des triglycérides
Le présent document spécifie une méthode de référence pour la détermination de la pureté des matières grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des triglycérides. La méthode utilise les différences d'empreintes des triglycérides présents dans les matières grasses laitières par rapport aux empreintes des triglycérides individuels des autres matières grasses et huiles pour déterminer des échantillons se situant en dehors de la plage normalement observée pour les matières grasses laitières. Cela est réalisé en utilisant les formules de triglycérides définies basées sur la somme pondérée normalisée des pics de triglycérides individuels, qui sont sensibles à l'intégrité du lait[6][7]. L'intégrité des matières grasses laitières peut être déterminée en comparant les résultats de ces formules à ceux précédemment observés pour une gamme d'échantillons de matières grasses laitières pures[12]. Il est possible de détecter des matières grasses d'origines végétale et animale telles que la graisse de bœuf et le saindoux. La méthode s'applique au lait en vrac, ou aux produits laitiers dérivés, indépendamment de la variation des pratiques d'alimentation courantes et des conditions d'élevage ou de lactation. Elle s'applique en particulier aux matières grasses extraites de produits laitiers supposés contenir des matières grasses laitières pures, présentant une composition non modifiée, comme le beurre, la crème, le lait et le lait en poudre. Un résultat faux positif pouvant être obtenu, la méthode n'est pas applicable à la matière grasse laitière liée aux circonstances listées ci-après: a) issue de lait de bovin autre que le lait de vache; b) issue de vaches individuelles; c) issue de vaches dont l'alimentation contenait une proportion particulièrement élevée d'huiles végétales telles que l'huile de colza, l'huile de coton ou de palme, etc.; d) issue de vaches souffrant d'une grave sous-alimentation (puissant déficit énergétique); e) issue du colostrum; f) soumise à un traitement technologique tel que l'élimination du cholestérol ou le fractionnement; g) issue du lait écrémé, du lait battu (babeurre) ou du lactosérum; h) issue de fromages présentant une lipolyse importante; i) extraite selon les méthodes Gerber, Weibull?Berntrop ou Schmid?Bondzynski?Ratzlaff, ou isolée au moyen de détergents [par exemple méthode BDI (Bureau of Dairy Industries)]. Avec les méthodes d'extraction spécifiées en i), d'importantes quantités de glycérides ou phospholipides partiels peuvent passer dans la phase grasse. NOTE 1 Dans la nature, l'acide butyrique (n-butanoïque) (C4) se trouve exclusivement dans les matières grasses laitières et permet d'effectuer des estimations quantitatives de petites et moyennes quantités de matières grasses laitières dans les graisses végétales et animales. En raison de la grande variation de C4, pour lequel la fraction massique est comprise approximativement entre 3,1 % et 3,8 % de la matière grasse, des informations qualitatives et quantitatives peuvent difficilement être fournies lorsque le rapport des matières grasses étrangères aux matières grasses laitières pures atteint jusqu'à 20 % en fraction massique[11]. NOTE 2 Dans la pratique, des résultats quantitatifs ne peuvent pas être déduits de la teneur en stérols des matières grasses végétales, étant donné que celles-ci sont fonction des conditions de production et de traitement. En outre, la détermination qualitative de matières grasses étrangères au moyen de stérols est ambiguë. NOTE 3 En raison de pratiques d'alimentation spéciales telles que liées à c) et d), des résultats faux positifs ont parfois été signalés pour le lait provenant de certaines régions d'Asie[15]. En outre, l'alimentation à base d'herbe uniquement, comme c'est le cas dans les régions montagneuses et en particulier dans les pâturages d'altitude, peut parfois entraîner des résultats faux positifs, ce qui peut être justifié par une teneur en acide linoléique conjugué (C18:2 c
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17678
IDF 202
Second edition
2019-06
Milk and milk products —
Determination of milk fat purity
by gas chromatographic analysis of
triglycerides
Lait et produits laitiers — Détermination de la pureté des matières
grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse
des triglycérides
Reference numbers
IDF 202:2019(E)
©
ISO and IDF 2019
IDF 202:2019(E)
© ISO and IDF 2019
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IDF 202:2019(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 3
7 Sampling . 4
8 Procedure. 5
8.1 Preparation of test samples . 5
8.1.1 General. 5
8.1.2 Isolation from butter or butteroil. 5
8.1.3 Extraction according to the Röse–Gottlieb gravimetric method . 5
8.1.4 Extraction from milk using silica gel columns . 5
8.1.5 Extraction from cheese . 6
8.2 Preparation of fat sample solution . 6
8.3 Chromatographic triglyceride determination . 6
8.3.1 Baseline drift . 6
8.3.2 Injection technique . 6
8.3.3 Calibration . 6
8.3.4 Chromatographic conditions . 7
9 Integration, evaluation and control of the analytical performance .8
10 Calculation and expression of results .10
10.1 Triglyceride composition .10
10.1.1 Calculation .10
10.1.2 Expression of test results .10
10.2 S-values .11
10.2.1 Calculation .11
10.2.2 Expression of test results .11
10.3 Detection of foreign fat.11
11 Precision .12
11.1 Interlaboratory test.12
11.2 Repeatability .12
11.3 Reproducibility .12
12 Test report .13
Annex A (normative) Preparation of the packed column .14
Annex B (informative) Quantification of the foreign fat content .18
Annex C (informative) Uncertainty of measurement .20
Annex D (informative) Interlaboratory test .21
Bibliography .23
IDF 202:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 17678 | IDF 202:2010), which has been
technically revised. The following changes have been made:
— the Scope has been restricted to exclude milk fat obtained from special feeding practices and
from whey;
— the Scope has been extended to include milk fat obtained from cheese showing low lipolysis;
— the Normative references have been updated to reflect the modified scope;
— a method has been added for the fat extraction from cheese;
— the Bibliography has been expanded.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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IDF 202:2019(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition and
ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is
being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the Joint ISO/IDF Action Team C23 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Composition under the aegis of its project leader, Mr J. Molkentin (DE).
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 202:2019(E)
Milk and milk products — Determination of milk fat purity
by gas chromatographic analysis of triglycerides
1 Scope
This document specifies a reference method for the determination of milk fat purity using gas
chromatographic analysis of triglycerides. The method utilizes the differences in triglyceride
fingerprint of milk fat from the individual triglyceride fingerprints of other fats and oils to determine
samples which are outside the range normally observed for milk fat. This is achieved by using the
defined triglyceride formulae based on the normalized weighted sum of individual triglyceride peaks
[6][7]
which are sensitive to the integrity of the milk . The integrity of the milk fat can be determined
by comparing the result of these formulae with those previously observed for a range of pure milk fat
[12]
samples . Both vegetable fats and animal fats such as beef tallow and lard can be detected.
The method is applicable to bulk milk, or products made thereof, irrespective of the variation in
common feeding practices, breed or lactation conditions. In particular, the method is applicable to fat
extracted from milk products purporting to contain pure milk fat with unchanged composition, such as
butter, cream, milk and milk powder.
Because a false-positive result can occur, the method does not apply to milk fat related to these
circumstances:
a) obtained from bovine milk other than cow’s milk;
b) obtained from single cows;
c) obtained from cows whose diet contained a particularly high proportion of vegetable oils such as
rapeseed, cotton or palm oil, etc.;
d) obtained from cows suffering from serious underfeeding (strong energy deficit);
e) obtained from colostrum;
f) subjected to technological treatment such as removal of cholesterol or fractionation;
g) obtained from skim milk, buttermilk or whey;
h) obtained from cheeses showing increased lipolysis;
i) extracted using the Gerber, Weibull–Berntrop or Schmid–Bondzynski–Ratzlaff methods, or that
has been isolated using detergents (e.g. the Bureau of Dairy Industries method).
With the extraction methods specified in i), substantial quantities of partial glycerides or phospholipids
can pass into the fat phase.
NOTE 1 In nature, butyric (n-butanoic) acid (C4) occurs exclusively in milk fat and enables quantitative
estimations of low to moderate amounts of milk fat in vegetable and animal fats to be made. Due to the large
variation of C4, for which the approximate content ranges from 3,1 % fat mass fraction to 3,8 % fat mass fraction,
it is difficult to provide qualitative and quantitative information for foreign fat to pure milk fat ratios of up to
[11]
20 % mass fraction .
NOTE 2 In practice, quantitative results cannot be derived from the sterol content of vegetable fats, because
they depend on production and processing conditions. Furthermore, the qualitative determination of foreign fat
using sterols is ambiguous.
IDF 202:2019(E)
NOTE 3 Due to special feeding practices such as those related to c) and d), false-positive results have
[15]
sometimes been reported for milk from certain Asian regions . Moreover, grass-only diets such as mountain
and, in particular, highland pasture feeding sometimes cause false-positive results, which can be substantiated
[16][17]
by a content of conjugated linoleic acid (C18:2 c9t11) of ≥ 1,3 % fatty acid mass fraction . Nevertheless,
results conforming to the criteria of milk fat purity specified in this document are accepted, even if samples were
undoubtedly produced under conditions reported in this note, including those described in h).
NOTE 4 In cases where a positive result is suspected to be caused by circumstances related to c) or d), another
analytical method, such as fatty acid or sterol analysis, can be applied to confirm the finding. Due to similar or
increased limitations (e.g. as described in NOTE 1 and NOTE 2), a negative result obtained by another method is
not appropriate to contrastingly confirm milk fat purity.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 1211 | IDF 1, Milk — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method)
ISO 1740 | IDF 6, Milkfat products and butter — Determination of fat acidity (Reference method)
ISO 1736 | IDF 9, Dried milk and dried milk products — Determination of fat content — Gravimetric method
(Reference method)
ISO 2450 | IDF 16, Cream — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method)
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 7328 | IDF 116, Milk-based edible ices and ice mixes — Determination of fat content — Gravimetric
method (Reference method)
ISO 14156 | IDF 172, Milk and milk products — Extraction methods for lipids and liposoluble compounds
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
3.1
milk fat purity
absence of vegetable and animal fats determined by the procedure specified in this document
Note 1 to entry: The purity is determined using S-values, which are calculated from the content of triglycerides.
Triglyceride mass fractions are expressed as percentages.
4 Principle
Fat extracted from milk or milk products is analysed by gas chromatography (GC) using a packed
or a short capillary column to determine triglycerides (TGs), separated by total carbon numbers. By
inserting the mass fraction, expressed as a percentage, of fat molecules of different sizes (C24 to C54,
using even C numbers only) into suitable TG formulae, S-values are calculated. If the S-values exceed the
limits established with pure milk fat, the presence of foreign fat is detected.
NOTE 1 The suitability and equivalence of both packed and capillary columns have been demonstrated
[8][9][10]
previously .
2 © ISO and IDF 2019 – All rights reserved
IDF 202:2019(E)
NOTE 2 An S-value is the sum of weighted TG mass fractions.
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water, conforming to the requirements of ISO 3696, grade 2.
5.2 Carrier gas, nitrogen or, alternatively, helium or hydrogen, all with a purity of at least 99,995 %
volume fraction.
5.3 Fat standards, as described in 5.3.1 and 5.3.2.
5.3.1 Triglyceride standards, saturated, with a purity of at least 99 % mass fraction, for standardizing
the milk fat standard described in 8.3.3 (suitable products are available commercially).
5.3.2 Cholesterol standard, with a purity of at least 99 % mass fraction, for standardizing the milk fat
standard described in 8.3.3.
5.4 Methanol, with a water content of not more than 0,05 % mass fraction.
5.5 n-Hexane.
5.6 n-Heptane.
5.7 Other gases, hydrogen, purity at least 99,995 % volume fraction, free from organic impurities
(C H < 1 µl/l); synthetic air, free from organic impurities (C H < 1 µl/l).
n m n m
5.8 Anhydrous sodium sulfate.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 High-temperature gas chromatograph, suitable for use at temperatures of at least 400 °C and
equipped with a flame ionization detector (FID). For capillary GC, an on-column or a programmed
temperature vaporization injector is indispensable while a split injector is unsuitable.
Septa used in the injector shall withstand high temperatures and exhibit a very low degree of “bleeding”.
Always use graphite seals to connect the column as well as injector and/or detector inserts (where
applicable).
6.2 Packed chromatography column, glass, of internal diameter 2 mm and length 500 mm, packed
1)
with a stationary phase of 3 % OV-1 on 125 µm to 150 µm (100 to 120 mesh) Gas ChromQ .
The preparation, silanization, packing and conditioning of the packed column are described in Annex A.
Alternatively, a capillary column (6.3) may be used.
1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of
this document and does not constitute an endorsement by ISO or by IDF of this product.
IDF 202:2019(E)
6.3 Capillary chromatography column, short, e.g. of length 5 m, with a non-polar stationary phase
2)
that can withstand temperatures up to 400 °C or more .
Condition the column by performing 20 analyses of a milk fat solution (see 8.2) within no more than
two days using the settings given in 8.3.4.3. After that, ensure that the response factors (see 8.3.3) are
close to 1 and not higher than 1,250 0.
Because of the variable overlap between C24 and cholesterol, a higher response factor may be accepted
for C24.
Columns with different dimensions and a different non-polar, highly temperature-resistant phase may
be used as long as their performance is consistent with this document. However, the column length is
restricted by the indispensable limitation in resolution as shown in Figure 1. See also 8.3.4.3.
1)
6.4 Extrelut column , capacity 1 ml to 3 ml, filled with silica gel, for the extraction of milk fat in
accordance with 8.1.4 only.
6.5 Graphite seals, capable of withstanding temperatures of at least 400 °C; for the connection of the
GC column as well as for the injector and/or detector inserts.
6.6 Water bath, capable of being maintained at 50 °C ± 2 °C.
6.7 Oven, capable of operating at 50 °C ± 2 °C and 100 °C ± 2 °C.
6.8 Micropipette.
[2]
6.9 Graduated pipette, capacity 5 ml, in accordance with ISO 835 , class A.
6.10 Round-bottomed flask, capacity 50 ml.
6.11 Erlenmeyer flask, nominal capacity 250 ml.
6.12 Funnel.
6.13 Fine-pored filter paper.
6.14 Rotary evaporator.
6.15 Ampoules, nominal capacity 1 ml, fitted with a polytetrafluoroethylene-lined aluminium crimp
cap or screw cap.
6.16 Injection syringe, with syringe plunger not reaching into the tip of the needle (packed column GC).
NOTE With these syringes, better repeatability of the results is obtained.
6.17 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with a readability of 0,1 mg.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. A recommended sampling method is
[1]
given in ISO 707 | IDF 50 .
2) CP-Ultimetal SimDist (5 m, 0,53 mm, 0,17 µm) is an example of a suitable product available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
or by IDF of this product.
4 © ISO and IDF 2019 – All rights reserved
IDF 202:2019(E)
A representative sample should be sent to the laboratory. It should not be damaged or changed during
transport or storage.
8 Procedure
8.1 Preparation of test samples
8.1.1 General
For the preparation of test samples, use one of the milk fat isolation or extraction methods specified in
8.1.2 to 8.1.5.
8.1.2 Isolation from butter or butteroil
Melt 50 g to 100 g of test sample in the water bath (6.6) or the oven (6.7) at 50 °C.
Add 0,5 to 1,0 g of sodium sulfate (5.8) to a folded filter paper (6.13). Preheat a 250 ml Erlenmeyer flask
(6.11) and a funnel (6.12) with the filter paper inserted, containing the sodium sulfate, in the oven (6.7)
at 50 °C.
When a limited amount of test sample is available, use a smaller test sample and adapt the procedure
accordingly.
However, note that the handling of a smaller test portion involves a higher risk of obtaining a non-
representative sample.
While keeping the preheated flask, funnel and inserted filter device in the oven, filter the fat layer of the
molten sample without transferring any serum.
NOTE 1 Butter can be obtained from cream by churning and thorough washing of the resulting butter grains.
NOTE 2 The milk fat obtained using the procedure in this subclause is almost free of phospholipids.
8.1.3 Extraction according to the Röse–Gottlieb gravimetric method
Extract the fat fraction from the test sample using the gravimetric method specified in one of
ISO 1211 | IDF 1, ISO 1736 | IDF 9, ISO 2450 | IDF 16 or ISO 7328 | IDF 116.
8.1.4 Extraction from milk using silica gel columns
Temper the milk to 20 °C. Using a micropipette (6.8), add 0,7 ml of the sample thus prepared into a
1 ml to 3 ml Extrelut column (6.4). Allow the sample to distribute uniformly on the silica gel for
approximately 5 min.
To denature the protein–lipid complexes, using the graduated pipette (6.9), add 1,5 ml of methanol
(5.4) into the Extrelut column. Subsequently, extract the fat fraction from the test sample with 20 ml
of n-hexane (5.5). Add the n-hexane slowly in small amounts. Collect the solvent draining off in a 50 ml
round-bottomed flask (6.10) previously dried to a constant, known mass weighed to the nearest 1 mg
and record the mass to 0,1 mg.
Allow the column to drain until empty after the extraction. Distil off the solvents from the eluate on a
rotary evaporator (6.14) with its water bath maintained at between 40 °C and 50 °C.
After distilling off the solvents, dry and subsequently weigh the round-bottomed flask and its contents
to the nearest 1 mg, recording the mass to 0,1 mg. Determine the fat mass yield by subtracting the mass
of the dried empty round-bottomed flask from the mass obtained.
IDF 202:2019(E)
Depending on the fat content of the milk and the required concentration of the sample solution,
decide whether it is necessary to combine the yield of two or more extractions to obtain an adequate
amount of fat.
8.1.5 Extraction from cheese
Extract the cheese fat fraction from the test sample using the method specified in ISO 14156 | IDF 172.
With cheeses typically showing increased lipolysis, which often occurs with mould-ripened and long-
ripened cheeses, determine the fat acidity using the method specified in ISO 1740 | IDF 6. If the acidity
[18][19]
is higher than 8 mmol/100 g of fat, the standard is not applicable .
8.2 Preparation of fat sample solution
For gas chromatography with a packed column, prepare a 5 % volume fraction solution of the melted
fat obtained in 8.1.2, 8.1.3, 8.1.4 or 8.1.5 in n-hexane (5.5) or n-heptane (5.6). Depending on the column
dimensions, use a concentration of 1 % [0,53 mm internal diameter (ID), wide-bore] or lower for on-
column injection with a capillary column.
When using the fat sample prepared in 8.1.4, calculate the amount of solvent (5.5 or 5.6) to be added to
the test sample in the flask by equating the mass of fat obtained with its volume.
Completely dissolve the fat in the solvent used. Transfer approximately 0,5 ml to 1 ml of the obtained fat
sample solution into an ampoule (6.15).
8.3 Chromatographic triglyceride determination
8.3.1 Baseline drift
To minimize baseline rising, condition the column as specified in 6.3 (capillary column) or in A.5
(packed column).
NOTE Because of the high column temperature, the analysis of TGs is particularly susceptible to a rise of the
baseline in the high carbon-number range.
8.3.2 Injection technique
8.3.2.1 Packed column
To avoid discrimination effects and to improve the quantification of the high-boiling TG components,
apply the hot-needle technique.
Fill the needle with air by drawing up the fat solution into the body of the syringe. Insert the needle into
the injector. Heat the needle prior to injection for about 3 s. Then, rapidly inject the syringe contents.
8.3.2.2 Capillary column
When using cool on-column injection (see 8.3.4.3), insert the needle of the syringe and inject
immediately. Choose a suitable subsequent dwell time of the needle in the injector so as to avoid broad
tailing of the solvent peak.
NOTE The optimum dwell time is typically about 3 s.
8.3.3 Calibration
8.3.3.1 General
For the calibration of test samples, perform two to three analyses of standardized milk fat at the
beginning of each working day. Use the last analysis of the standardized milk fat to determine the
6 © ISO and IDF 2019 – All rights reserved
I
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17678
FIL 202
Deuxième édition
2019-05
Lait et produits laitiers —
Détermination de la pureté des
matières grasses laitières par analyse
chromatographique en phase gazeuse
des triglycérides
Milk and milk products — Determination of milk fat purity by gas
chromatographic analysis of triglycerides
Numéros de référence
FIL 202:2019(F)
©
ISO et FIL 2019
FIL 202:2019(F)
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FIL 202:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Mode opératoire. 5
8.1 Préparation des échantillons pour essai . 5
8.1.1 Généralités . 5
8.1.2 Séparation des matières grasses laitières du beurre ou de l’huile de beurre . 5
8.1.3 Extraction conformément à la méthode gravimétrique de Röse–Gottlieb . 6
8.1.4 Extraction du lait au moyen de colonnes de gel de silice . 6
8.1.5 Extraction à partir de fromage. 6
8.2 Préparation de l’échantillon de matière grasse . 6
8.3 Analyse chromatographique des triglycérides . 7
8.3.1 Dérive de la ligne de base . 7
8.3.2 Technique d’injection . 7
8.3.3 Étalonnage . 7
8.3.4 Conditions chromatographiques . 8
9 Intégration, évaluation et contrôle de la performance analytique .9
10 Calcul et expression des résultats .11
10.1 Composition des triglycérides .11
10.1.1 Calcul .11
10.1.2 Expression des résultats d’essai .11
10.2 Valeurs de S . 12
10.2.1 Calcul .12
10.2.2 Expression des résultats d’essai .12
10.3 Détection des matières grasses étrangères .12
11 Fidélité .13
11.1 Essai interlaboratoires .13
11.2 Répétabilité .13
11.3 Reproductibilité .13
12 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Préparation de la colonne remplie .15
Annexe B (informative) Quantification des matières grasses étrangères .19
Annexe C (informative) Incertitude de mesure .21
Annexe D (informative) Essai interlaboratoires .22
Bibliographie .25
© ISO et FIL 2019 – Tous droits réservés iii
FIL 202:2019(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers et la Fédération internationale du lait (FIL). Il est publié conjointement par
l'ISO et la FIL.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 17678 | FIL 202:2010) qui a fait
l’objet d’une révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont
les suivantes:
— le Domaine d’application a été réduit afin d’exclure les matières grasses laitières issues de pratiques
d’alimentation spéciales et de lactosérum;
— le Domaine d’application a été étendu afin d’inclure les matières grasses laitières issues de fromages
présentant une faible lipolyse;
— les Références normatives ont été actualisées afin de refléter le domaine d’application modifié;
— une méthode a été ajoutée pour l’extraction des matières grasses à partir de fromage;
— la Bibliographie a été étendue.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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FIL 202:2019(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l'industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d'analyse et d'échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes d’analyse de
la composition de la Fédération internationale du lait (FIL) et le comité technique ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l'ISO et la FIL.
Le travail a été confié à l’Équipe d’action conjointe ISO/FIL C23, du Comité permanent de la FIL chargé
des Méthodes d’analyse de la composition, sous la conduite de son chef de projet, M. J. Molkentin (DE).
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NORME INTERNATIONALE
FIL 202:2019(F)
Lait et produits laitiers — Détermination de la pureté des
matières grasses laitières par analyse chromatographique
en phase gazeuse des triglycérides
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de référence pour la détermination de la pureté des matières
grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des triglycérides. La méthode utilise
les différences d’empreintes des triglycérides présents dans les matières grasses laitières par rapport
aux empreintes des triglycérides individuels des autres matières grasses et huiles pour déterminer des
échantillons se situant en dehors de la plage normalement observée pour les matières grasses laitières.
Cela est réalisé en utilisant les formules de triglycérides définies basées sur la somme pondérée
[6][7]
normalisée des pics de triglycérides individuels, qui sont sensibles à l’intégrité du lait . L’intégrité
des matières grasses laitières peut être déterminée en comparant les résultats de ces formules à ceux
[12]
précédemment observés pour une gamme d’échantillons de matières grasses laitières pures . Il est
possible de détecter des matières grasses d’origines végétale et animale telles que la graisse de bœuf et
le saindoux.
La méthode s’applique au lait en vrac, ou aux produits laitiers dérivés, indépendamment de la variation
des pratiques d’alimentation courantes et des conditions d’élevage ou de lactation. Elle s’applique en
particulier aux matières grasses extraites de produits laitiers supposés contenir des matières grasses
laitières pures, présentant une composition non modifiée, comme le beurre, la crème, le lait et le lait
en poudre.
Un résultat faux positif pouvant être obtenu, la méthode n’est pas applicable à la matière grasse laitière
liée aux circonstances listées ci-après:
a) issue de lait de bovin autre que le lait de vache;
b) issue de vaches individuelles;
c) issue de vaches dont l’alimentation contenait une proportion particulièrement élevée d’huiles
végétales telles que l’huile de colza, l’huile de coton ou de palme, etc.;
d) issue de vaches souffrant d’une grave sous-alimentation (puissant déficit énergétique);
e) issue du colostrum;
f) soumise à un traitement technologique tel que l’élimination du cholestérol ou le fractionnement;
g) issue du lait écrémé, du lait battu (babeurre) ou du lactosérum;
h) issue de fromages présentant une lipolyse importante;
i) extraite selon les méthodes Gerber, Weibull–Berntrop ou Schmid–Bondzynski–Ratzlaff, ou isolée
au moyen de détergents [par exemple méthode BDI (Bureau of Dairy Industries)].
Avec les méthodes d’extraction spécifiées en i), d’importantes quantités de glycérides ou phospholipides
partiels peuvent passer dans la phase grasse.
NOTE 1 Dans la nature, l’acide butyrique (n-butanoïque) (C4) se trouve exclusivement dans les matières
grasses laitières et permet d’effectuer des estimations quantitatives de petites et moyennes quantités de
matières grasses laitières dans les graisses végétales et animales. En raison de la grande variation de C4, pour
lequel la fraction massique est comprise approximativement entre 3,1 % et 3,8 % de la matière grasse, des
informations qualitatives et quantitatives peuvent difficilement être fournies lorsque le rapport des matières
[11]
grasses étrangères aux matières grasses laitières pures atteint jusqu’à 20 % en fraction massique .
© ISO et FIL 2019 – Tous droits réservés 1
FIL 202:2019(F)
NOTE 2 Dans la pratique, des résultats quantitatifs ne peuvent pas être déduits de la teneur en stérols des
matières grasses végétales, étant donné que celles-ci sont fonction des conditions de production et de traitement.
En outre, la détermination qualitative de matières grasses étrangères au moyen de stérols est ambiguë.
NOTE 3 En raison de pratiques d’alimentation spéciales telles que liées à c) et d), des résultats faux positifs ont
[15]
parfois été signalés pour le lait provenant de certaines régions d’Asie . En outre, l’alimentation à base d’herbe
uniquement, comme c’est le cas dans les régions montagneuses et en particulier dans les pâturages d’altitude,
peut parfois entraîner des résultats faux positifs, ce qui peut être justifié par une teneur en acide linoléique
[16][17]
conjugué (C18:2 c9t11) ≥ 1,3 % de la fraction massique . Néanmoins, les résultats conformes aux critères de
pureté des matières grasses laitières spécifiés dans la présente norme sont acceptés, même si les échantillons ont
sans aucun doute été produits dans les conditions indiquées dans cette note, y compris celles décrites en h).
NOTE 4 Dans les cas où il est suspecté qu’un résultat positif soit causé par des circonstances liées à c) ou
d), une autre méthode analytique, comme l’analyse des acides gras ou des stérols, peut être appliquée pour
confirmer le résultat. En raison de limites similaires ou accrues (par exemple, comme décrit dans NOTE 1 et
NOTE 2), un résultat négatif obtenu par une autre méthode n’est en revanche pas approprié pour confirmer la
pureté des matières grasses laitières.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 1211 | FIL 1, Lait — Détermination de la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique (Méthode
de référence)
ISO 1740 | FIL 6, Produits à matière grasse laitière et beurre — Détermination de l'acidité de la matière
grasse (Méthode de référence)
ISO 1736 | FIL 9, Lait sec et produits à base de lait sec — Détermination de la teneur en matière grasse —
Méthode gravimétrique (Méthode de référence)
ISO 2450 | FIL 16, Crème — Détermination de la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique
(Méthode de référence)
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 7328 | FIL 116, Glaces de consommation et préparations pour glaces à base de lait — Détermination de
la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique (Méthode de référence)
ISO 14156 | FIL 172, Lait et produits laitiers — Méthodes d'extraction des lipides et des composés
liposolubles
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
2 © ISO et FIL 2019 – Tous droits réservés
FIL 202:2019(F)
3.1
pureté des matières grasses laitières
absence de graisses végétales et animales déterminée selon le mode opératoire spécifié dans le présent
document
Note 1 à l'article: La pureté est déterminée à l’aide de valeurs de S qui sont calculées à partir de la composition
des triglycérides. Les fractions massiques des triglycérides sont exprimées en pourcentages.
4 Principe
La matière grasse extraite du lait ou des produits laitiers est analysée par chromatographie en phase
gazeuse (CG) sur une colonne remplie ou une colonne capillaire courte pour doser les triglycérides
(TG), lesquels se distinguent en fonction de leur nombre total d’atomes de carbone. Les valeurs de S
sont calculées en insérant la fraction massique, exprimée en pourcentage, correspondant au poids des
molécules de matières grasses de différentes tailles (C24 à C54 en utilisant uniquement les nombres de
C pairs) dans des formules de TG appropriées. Si les valeurs de S dépassent les limites établies pour de
la matière grasse laitière pure, la présence de matières grasses étrangères est avérée.
NOTE 1 L’aptitude à l’emploi des colonnes remplie et capillaire a déjà été démontrée, tout comme les conditions
[8][9][10]
de leur équivalence .
NOTE 2 La valeur de S est la somme des fractions massiques pondérées des TG.
5 Réactifs
Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue.
5.1 Eau, conforme aux exigences de l’ISO 3696, qualité 2.
5.2 Gaz vecteur, azote ou, en variante, hélium ou hydrogène, tous d’une pureté d’au moins 99,995 %
en fraction volumique.
5.3 Étalons de matière grasse, comme décrit en 5.3.1 et 5.3.2.
5.3.1 Étalons de triglycérides, saturés, d’une pureté d’au moins 99 % en fraction massique, pour
l’étalonnage de l’étalon de matière grasse laitière décrit en 8.3.3 (des produits adaptés sont disponibles
dans le commerce).
5.3.2 Étalon de cholestérol, d’une pureté d’au moins 99 % en fraction massique, pour l’étalonnage de
l’étalon de matière grasse laitière décrit en 8.3.3.
5.4 Méthanol, ayant une teneur maximale en eau de 0,05 % en fraction massique.
5.5 n-Hexane.
5.6 n-Heptane.
5.7 Autres gaz, hydrogène, d’une pureté d’au moins 99,995 % en fraction volumique, exempt
d’impuretés organiques (C H < 1 µl/l); air synthétique, exempt d’impuretés organiques (C H < 1 µl/l).
n m n m
5.8 Sulfate de sodium anhydre.
© ISO et FIL 2019 – Tous droits réservés 3
FIL 202:2019(F)
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Chromatographe en phase gazeuse à haute température, adapté pour une utilisation à des
températures de 400 °C au minimum et équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (DIF). En cas de CG
sur colonne capillaire, il est essentiel d’utiliser un système d’injection sur colonne (à dépôt direct) ou un
injecteur à température programmée (PTV), tandis qu’un injecteur à division de flux ne convient pas.
Les septums utilisés dans l’injecteur doivent résister à des températures élevées et présenter un très
faible degré «d’écoulement». Utiliser uniquement des joints de graphite pour le raccordement de la
colonne ainsi que pour l’insert dans le détecteur et/ou l’injecteur (le cas échéant).
6.2 Colonne chromatographique «remplie», en verre ayant un diamètre intérieur de 2 mm et une
longueur de 500 mm, remplie d’une phase stationnaire OV-1 3 % sur 125 µm à 150 µm (100 mesh à
1)
120 mesh) Gas ChromoQ .
La préparation, la silanisation, le garnissage et le conditionnement de la colonne remplie sont décrits
dans l’Annexe A.
En variante, une colonne capillaire (6.3) peut être utilisée.
6.3 Colonne chromatographique «capillaire», courte, par exemple de 5 m de long, avec une phase
2)
stationnaire non polaire pouvant résister à des températures de l’ordre de 400 °C ou plus .
Conditionner la colonne en effectuant 20 analyses d’une solution de matières grasses laitières (voir 8.2)
dans un délai n’excédant pas plus de deux jours, avec les réglages indiqués en 8.3.4.3. Après cela, les
facteurs de réponse (voir 8.3.3) doivent se situer autour de 1 sans dépasser 1,250 0.
En raison du chevauchement variable entre le C24 et le cholestérol, un facteur de réponse supérieur
peut être admis pour le C24.
Il est permis d’utiliser des colonnes de dimensions différentes et avec une phase non polaire différente
résistant à des températures élevées à condition qu’elles présentent des performances compatibles avec
le présent document. Toutefois, la longueur de la colonne est restreinte par la limitation indispensable
de la résolution comme illustré à la Figure 1. Voir également 8.3.4.3.
1)
6.4 Colonne Extrelut , d’une capacité de 1 ml à 3 ml, remplie de gel de silice, requise uniquement
pour l’extraction de la matière grasse laitière conformément à 8.1.4.
6.5 Joints de graphite, capables de résister à des températures de 400 °C au minimum; à utiliser pour
le raccordement de la colonne CG ainsi que pour l’insert dans le détecteur et/ou l’injecteur.
6.6 Bain d’eau, pouvant être maintenu à une température de (50 ± 2) °C.
6.7 Étuve, capable de fonctionner à (50 ± 2) °C et à 100 ± 2) °C.
6.8 Micropipette.
[2]
6.9 Pipette graduée, d’une capacité de 5 ml, conforme à l’ISO 835 , classe A.
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
2) CP-Ultimetal SimDist (5 m, 0,53 mm, 0,17 µm) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou
la FIL approuvent ou recommandent l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
4 © ISO et FIL 2019 – Tous droits réservés
FIL 202:2019(F)
6.10 Fiole à fond rond, d’une capacité de 50 ml.
6.11 Fiole Erlenmeyer, d’une capacité nominale de 250 ml.
6.12 Entonnoir.
6.13 Papier-filtre à micropores.
6.14 Évaporateur rotatif.
6.15 Ampoules, d’une capacité nominale de 1 ml, munies d’un capuchon serti ou vissé en aluminium
revêtu de polytétrafluoroéthylène.
6.16 Seringue à injection, le piston de la seringue ne devant pas toucher le bout de l’aiguille (CG sur
colonne remplie).
NOTE Ces seringues permettent d’obtenir une meilleure répétabilité des résultats.
6.17 Balance analytique, capable de peser à 1 mg près, avec une lisibilité de 0,1 mg.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode
[1]
d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 707 | FIL 50 .
Il convient qu’un échantillon représentatif soit transmis au laboratoire. Il convient qu’il ne soit pas
endommagé ou modifié pendant le transport ou le stockage.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation des échantillons pour essai
8.1.1 Généralités
Pour la préparation des échantillons pour essai, utiliser l’une des méthodes d’isolement ou d’extraction
des matières grasses laitières spécifiées en 8.1.2 à 8.1.5.
8.1.2 Séparation des matières grasses laitières du beurre ou de l’huile de beurre
Faire fondre de 50 g à 100 g de l’échantillon pour essai dans le bain d’eau (6.6) ou l’étuve (6.7) à 50 °C.
Placer de 0,5 g à 1,0 g de sulfate de sodium (5.8) sur un papier-filtre plié (6.13). Préchauffer, dans
l’armoire de dessiccation (6.7) réglée à 50 °C, une fiole Erlenmeyer de 250 ml (6.11) et un entonnoir
(6.12) dans lequel est inséré le papier-filtre contenant le sulfate de sodium.
Lorsque la quantité d’échantillon pour essai disponible est limitée, utiliser un échantillon pour essai
plus petit et adapter le mode opératoire en conséquence.
Noter toutefois que la mise en œuvre d’une prise d’essai plus petite engendre un risque plus élevé
d’obtenir un échantillon non représentatif.
En gardant dans l’étuve la fiole préchauffée, l’entonnoir et le dispositif de filtration inséré, filtrer la
couche de matières grasses de l’échantillon fondu sans transférer le sérum.
NOTE 1 Le beurre peut être obtenu à partir de crème en battant et lavant à fond les grains de beurre qui en
résultent.
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FIL 202:2019(F)
NOTE 2 La matière grasse laitière obtenue en utilisant le mode opératoire décrit dans le présent paragraphe
est presque exempte de phospholipides.
8.1.3 Extraction conformément à la méthode gravimétrique de Röse–Gottlieb
Extraire la fraction de matières grasses de l’échantillon pour essai à l’aide de la méthode gravimétrique
spécifiée dans l’ISO 1211 | FIL 1, l’ISO 1736 | FIL 9, l’ISO 2450 | FIL 16 ou l’ISO 7328 | FIL 116.
8.1.4 Extraction du lait au moyen de colonnes de gel de silice
Porter le lait à une température de 20 °C. À l’aide d’une micropipette (6.8), introduire 0,7 ml de
l’échantillon ainsi préparé dans une colonne Extrelut (6.4) de 1 ml à 3 ml de capacité. Laisser l’échantillon
se répartir uniformément sur le gel de silice pendant environ 5 min.
Pour dénaturer les complexes protéines-lipides, ajouter dans la colonne Extrelut 1,5 ml de méthanol
(5.4) avec la pipette graduée (6.9). Extraire ensuite la fraction de matières grasses de l’échantillon
pour essai avec 20 ml de n-hexane (5.5). Ajouter le n-hexane progressivement, par petites quantités.
Recueillir le solvant qui s’égoutte dans une fiole à fond rond de 50 ml (6.10), préalablement séchée
jusqu’à stabilisation, à 1 mg près, de sa masse à une valeur connue. Noter la masse à 0,1 mg près.
Après extraction, laisser la colonne s’écouler jusqu’à ce qu’elle soit vide. À partir de l’éluat, éliminer par
distillation les solvants sur un évaporateur rotatif (6.14), la température du bain d’eau étant maintenue
entre 40 °C et 50 °C.
Une fois les solvants éliminés par distillation, sécher puis peser la fiole à fond rond et son contenu à 1 mg
près et noter la masse à 0,1 mg près. Déterminer la masse de matières grasses obtenue en soustrayant
la masse de la fiole à fond rond, vide et séchée, de la masse obtenue.
Selon la teneur en matière grasse du lait et la concentration requise de la solution échantillon,
déterminer s’il est nécessaire de combiner le résultat de deux extractions, ou plus, pour obtenir une
quantité adéquate de matière grasse.
8.1.5 Extraction à partir de fromage
Extraire la fraction de matières grasses de l’échantillon pour essai à l’aide de la méthode spécifiée
dans l’ISO 14156 | FIL 172. Dans le cas des fromages présentant généralement une lipolyse importante,
comme c’est souvent le cas des fromages affinés aux moisissures et longuement affinés, déterminer
l’acidité de la matière grasse à l’aide de la méthode spécifiée dans l’ISO 1740 | FIL 6. Si l’acidité est
[18][19]
supérieure à 8 mmol/100 g de matière grasse, la norme n’est pas applicable .
8.2 Préparation de l’échantillon de matière grasse
Pour la chromatographie en phase gazeuse sur colonne remplie, préparer une solution à 5 % (fraction
volumique) de la matière grasse fondue obtenue en 8.1.2, 8.1.3, 8.1.4 ou 8.1.5 dans du n-hexane (5.5) ou
du n-heptane (5.6). En fonction des dimensions de la colonne, utiliser une concentration à 1 % [grand
diamètre intérieur (DI) 0,53 mm] ou inférieure en cas d’injection sur colonne (à dépôt direct) avec une
colonne capillaire.
Lorsque l’échantillon de matière grasse préparé en 8.1.4 est utilisé, calculer la quantité de solvant
(5.5 ou 5.6) à ajouter à l’échantillon pour essai dans la fiole en se fondant sur la masse de matière grasse
obtenue.
Dissoudre complètement la matière grasse dans le solvant utilisé. Transférer environ 0,5 ml à 1 ml de la
solution échantillon de matière grasse obtenue dans une ampoule (6.15).
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8.3 Analyse chromatographique des triglycérides
8.3.1 Dérive de la ligne de base
Pour réduire au minimum le relèvement de la ligne de base, conditionner la colonne comme spécifié en
6.3 (colonne capillaire) ou en A.5 (colonne remplie).
NOTE En raison des températures élevées dans la colonne, l’analyse des TG est particulièrement susceptible
de montrer un relèvement de la ligne de base dans la plage correspondant à un nombre élevé d’atomes de carbone.
8.3.2 Technique d’injection
8.3.2.1 Colonne remplie
Pour éviter des effets de discrimination et obtenir de meilleurs résultats quantitatifs avec les
composants de TG à point d’ébullition élevé, appliquer la technique «d’injection chaude».
Remplir l’aiguille avec de l’air en aspirant la solution de matière grasse dans le corps de la seringue.
Insérer l’aiguille dans l’injecteur. Chauffer l’aiguille préalablement à l’injection pendant environ 3 s, puis
injecter rapidement le contenu de la seringue.
8.3.2.2 Colonne capillaire
En cas d’injection à froid sur colonne (à dépôt direct) (voir 8.3.4.3), insérer l’aiguille de la seringue et
procéder immédiatement à l’injection. Choisir de manière adéquate le temps de séjour ultérieur de
l’aiguille dans l’orifice d’injection afin d’éviter l’apparition d’une large traînée du pic de solvant.
NOTE Le temps de séjour optimal est typiquement de l’ordre de 3 s.
8.3.3 Étalonnage
8.3.3.1 Généralités
En vue de l’étalonnage des échantillons pour essai, effectuer deux à trois analyses de la matière grasse
laitière étalonnée au début de chaque journée de travail. Utiliser la dernière analyse de la matière grasse
laitière étalonnée pour déterminer les facteurs de réponse f (fraction massique divisée par fraction
i
surfacique) des TG et du cholestérol et les appliquer aux échantillons pour essai ultérieurs (voir 10.1),
comme le montre la Formule (1):
wA×∑
ii
f = (1)
i
∑×wA
ii
où
w est la fraction massique, exprimée en pourcentage, de chaque TG ou du cholestérol présent
i
dans la matière grasse laitière étalonnée;
A est la valeur numérique de l’aire du pic de chaque TG ou du cholestérol présent dans la matière
i
grasse laitière étalonnée.
Exprimer les facteurs de réponse à quatre décimales.
Procéder conformément à 8.3.3.2 ou 8.3.3.3 pour obtenir une matière grasse étalonnée de composition
en TG connue.
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8.3.3.2 Étalon de matière grasse laitière commercial
3)
Utiliser une matière grasse laitière étalonnée dont la composition en TG est certifiée pour déterminer
le facteur de réponse de chaque composant de l’échantillon pour essai.
8.3.3.3 Étalon de matière grasse laitière réalisé en laboratoire
Préparer environ 1 g d’un mélange des étalons de matière grasse (5.3) (comprenant au moins les TG
saturés C24, C30, C36, C42, C48 et C54, ainsi que le cholestérol; plus, de préférence, C50 et C52) en
pesant à 1 mg près, et en notant la masse à 0,1 mg près pour obtenir une composition relative en TG
similaire à la matière grasse laitière.
Analyser à plusieurs reprises une solution du mélange d’étalons de matière grasse (concentration telle
qu’indiquée en 8.2) dans du n-hexane (5.5) ou du n-heptane (5.6) conformément à 8.3.4. Simultanément,
analyser à plusieurs reprises la matière grasse laitière de composition type.
Déterminer les facteurs de réponse des TG à partir du mélange d’étalons de matière grasse. Calculer
les facteurs de réponse intermédiaires des TG non présents dans le mélange par interpolation
mathématique. Appliquer les facteurs de réponse obtenus à la matière grasse laitière afin d’obtenir une
composition étalonnée.
La matière grasse laitière étalonnée ainsi obtenue peut être conservée pendant plusieurs années si elle
est conservée dans de l’azote à une température maximale de −18 °C.
8.3.4 Conditions chromatographiques
8.3.4.1 Généralités
L’utilisation d’une colonne remplie ou d’une colonne capillaire aboutit en général à une résolution
similaire à celle indiquée à la Figure 1. Bien qu’elle ne soit généralement pas constatée, éviter toute
division des TG à indice pair.
NOTE Des conditions chromatographiques inadaptées conduisent à la séparation de TG à indice pair ayant le
même nombre d’acyl-C, ce qui peut impacter une intégration correcte et la répétabilité.
8.3.4.2 Colonne remplie
8.3.4.2.1 Programme de température: régler la température initiale du four à 210 °C et la maintenir
constante pendant 1 min. Augmenter ensuite la température de 6 °C/min jusqu’à atteindre 350 °C.
Maintenir à cette température (finale) pendant 5 min.
8.3.4.2.2 Températures du détecteur et de l’injecteur: régler ces deux équipements à 370 °C.
8.3.4.2.3 Gaz vecteur: utiliser de l’azote à un débit constant d’environ 40 ml/min. Ajuster le débit exact
du gaz vecteur de sorte que C54 soit élué à 341 °C.
8.3.4.2.4 Durée de l’analyse: 29,3 min.
8.3.4.2.5 Volume d’injection: injecter 0,5 µl d’une solution échantillon à 5 % en fraction volumique.
8.3.4.2.6 Si aucune analyse de TG n’est effectuée, maintenir toutefois la température initiale du four
spécifiée en 8.3.4.2.1, les températures du détecteur et de l’injecteur spécifiées en 8.3.4.2.2, et le débit
3) MRC 519 (matière grasse laitière anhydre) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL
approuvent ou recommandent l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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du gaz vecteur spécifié en 8.3.4.2.3 à un niveau constant, y compris pendant la nuit, les week-ends et les
vacances. Cela assure une performance optimale de la colonne.
8.3.4.3 Colonne capillaire
8.3.4.3.1 Programme de température: régler la température initiale du four à 80 °C et la maintenir
constante pendant 0,5 min. Augmenter ensuite la température de 50 °C/min jusqu’à atteindre 190 °C,
puis de 6 °C/min jusqu’à atteindre 350 °C. Maintenir à cette température (finale) pendant 5 min.
8.3.4.3.2 Température du détecteur: régler la température à 370 °C.
8.3.4.3.3 Gaz vecteur: utiliser de l’azote à un débit constant d’environ 3 ml/min.
8.3.4.3.4 Durée de l’analyse: 34,4 min.
8.3.4.3.5 Volume d’injection: injecter 0,5 µl d’une solution échantillon à 1 % en fraction volumique.
8.3.4.3.6 Maintenir ces réglages pendant les périodes d’attente afin de garantir les meilleures
performances (voir 8.3.4.2.6).
En cas d’injection à froid sur colonne (à dépôt direct), régler la température de l’injecteur sur celle du
four pour obtenir les meilleurs résultats.
Les réglages analytiques indiqués dans ce paragraphe conviennent pour une utilisation avec un système
d’injection sur colonne (à dépôt direct) sur une colonne à grand diamètre (diamètre intérieur 0,53 mm)
comme spécifié en 6.3. En cas d’utilisation d’une colonne présentant d’autres dimensions ou phases, il
est permis d’appliquer des conditions différentes. Le domaine d’application prévoit l’utilisation d’une
[14]
technique de CG ultra-rapide . Dans tous les cas, avoir conscience de l’exigence essentielle relative à la
résolution appropriée (voir Figure 1).
9 Intégration, évaluation et contrôle de la performance analytique
Évaluer les pics du chromatogramme avec un système d’intégration capable de tracer et de réintégrer
la ligne de base.
La Figure 1 montre un exemple d’un chromatogramme correctement intégré, tandis que la Figure 2
montre un exemple d’erreur sporadique dans la ligne de base se terminant après C54 qui influe sur les
pourcentages de l’ensemble des TG. Exclure néanmoins de l’évaluation les pics élués après C54.
Combiner les TG présentant un indice impair de C acyle (2n + 1) avec le TG précédant à indice pair (2n). Ne
pas prendre en compte les faibles teneurs en C56. Multiplier les pourcentages des aires correspondant
aux TG restants, y compris le cholestérol, par les facteurs de réponse respectifs de la matière grasse
laitière étalonnée (dernier étalonnage) et les normaliser ensemble à 100 % conformément à 10.1.
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Légende
1 cholestérol
t temps
Figure 1 — Exemple d’un chromatogramme des TG présents dans de la matière grasse laitière,
la ligne de base étant réglée correctement
Légende
1 cholestérol
2 point limite de la ligne de base incorrecte
t temps
Figure 2 — Exemple d’un chromatogramme des TG présents dans de la matière grasse laitière,
la ligne de base étant réglée incorrectement
Pour contrôler les conditions de mesure, comparer les coefficients de variation, C , exprimés en
V
pourcentage, des différents TG obtenus à partir d’au moins 10 analyses, avec ceux indiqués dans le
Tableau 1 qui sont calculés à partir de 19 analyses consécutives sur le même échantillon de matière
grasse laitière.
Si les valeurs de C obtenues sont largement supérieures aux valeurs du Tableau 1, les conditions
V
chromatographiques ne sont pas satisfaisantes.
NOTE Les valeurs indiquées dans le Tableau 1 ne sont pas obligatoires. Elles sont fournies à titre indicatif
pour les besoins du contrôle qualité.
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Cependant, lorsque les valeurs de C supérieures sont admises, les limites de répétabilité et de
V
reproductibilité indiquées à l’Article 11 doivent néanmoins être respectées.
Tableau 1 — Coefficients de variation des teneurs en triglycérides
Coefficient de variation
C
Triglycéride V
%
C24 10,00
C26 2,69
C28 3,03
C30 1,76
C32 1,03
C34 0,79
C36 0,25
C38 0,42
C40 0,20
C42 0,26
C44 0,34
C46 0,37
C48 0,53
C50 0,38
C52 0,54
C54 0,75
10 Calcul et expression des résultats
10.1 Composition des triglycérides
10.1.1 Calcul
Calculer la fraction massique de chaque TG (pour i = C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42,
C44, C46, C48, C50, C52 à C54) plus le cholestérol, w , exprimée en pourcentage de la teneur totale en TG
i
de l’échantillon pour essai, à l’aide de la Formule (2):
Af×
ii
w = ×100 (2)
i
Af×
()
∑ ii
où
A est la valeur numérique de l’aire du pic de chaque TG dans l’échantillon pour essai;
i
f est le facteur de réponse de chaque TG déterminé par étalonnage (voir 8.3.3).
i
10.1.2 Expression des résultats d’essai
Exprimer les résultats à deux décimales.
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10.2 Valeurs de S
10.2.1 Calcul
10.2.1.1 Généralités
Calculer les valeurs de S en insérant le w calculé (voir 10
...
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