ISO/FDIS 17601

ISO/TC 190/SC 4
Secretariat: AFNOR
Date: 2025-05-1607-24
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from
DNA directly extracted from soil
FDIS stage
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may be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test materials . 5
5.1 DNA . 5
5.2 Bacteria . 5
5.3 Plasmid . 5
5.4 Enzymes . 5
5.5 Chemicals . 6
5.6 Products for bacterial culture medium . 6
5.7 Buffers and reagents . 7
6 Apparatus . 7
7 Procedure . 8
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) . 8
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) . 12
7.3 qPCR assay (task 3) . 15
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) . 16
8 Examination of the critical steps of the qPCR assay . 17
9 Expression of the results of the qPCR assay . 17
10 International ring test . 18
11 Test report . 18 ®
Annex A (informative) Description of principal steps of TaqMan qPCR assay . 19
Annex B (informative) International ring test for evaluating qPCR to quantify the abundance of
selected microbial gene sequences from DNA directly extracted from soil . 21
Annex C (informative) Examples of well-established primer systems for a qPCR-based
quantification of marker genes in soil samples . 39
Bibliography . 43

iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types of
ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent rights
in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO [had/had not] received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that this
may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO'sISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 17601:2016), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— Annex CAnnex C has been expanded by adding examples of well-established qPCR systems to quantify
certain microbial groups or their function.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organism, coding for enzymes responsible for their biological
activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different environmental matrices, by
means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply
distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eucaryoteseukaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex
environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under laboratory
conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent development of a large
set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a
pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods providing unique insight into the
[2][3][4][5][6[2][3][4][5][6] ]
composition, richness, and structure of microbial communities. . DNA-based approaches are
now well established in soil ecology and serve as genotypic markers for determining microbial diversity. The
results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition, and b) PCR bias
such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method
[7][4][8][9[7][4][8][9] ]
chosen for the analysis. .
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification, and
[10[10] ]
quantification of DNA from soils. . Recently, ISO 11063 reported “a method to extract nucleic acids
directly from soil samples” derived from Reference [10 [10],], opening a new window for developing
[11[11] ]
standardized molecular approaches to estimate soil quality. .
The aim of this document is to describe the procedure used to set up and perform quantitative PCR to quantify
the abundance of soil microbial phyla, as well as functional groups, from DNA directly extracted from soil
samples. The quantification of soil microbial phyla and functional groups by qPCR assays can contribute to the
development of routine tools to monitor soil quality. The repeatability and the reproducibility of the qPCR
procedure were assessed in an international ring test study (see Annex BAnnex B).). The repeatability of this
procedure was successfully evaluated for 16S rRNA genes and for genes coding a functional marker of
denitrifiers (the nitrite reductase gene nirK). The reproducibility of this procedure revealed a laboratory effect
which can be overcome by interpreting the results of the quantification of the abundance of the microbial
groups by comparison, either by using an external reference (DNA extracted from a control strain) in the assay
or by calculating a percentage of variations between treatments to normalize the data. It is noteworthy that
the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms that are measured. For
example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies in different bacterial phyla.
Therefore, the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA extracts does not give an exact
estimate of the number of soil bacteria. Furthermore, the number of sequences is not necessarily linked to
living microorganisms and can comprise sequences amplified from dead microorganisms.
A list of currently well-established qPCR assays to assess selected functional traits of the soil microbiome is
listed in Annex CAnnex C.
v
DRAFT International Standard ISO/DIS 17601:2024(en)

Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from
DNA directly extracted from soil
1 Scope
This document specifies the crucial steps of a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method to
measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract. The number of microbial
gene sequences quantified by qPCR provides an estimation of the abundance of selected microbial groups in
soil.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 11063, Soil quality — Direct extraction of soil DNA
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— — ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— — IEC Electropedia: available at https://www.electropedia.org/
3.1 3.1
soil DNA
DNA extracted from living and dead biota in the soil
Note the 1 to entry: The soil biota includes microorganisms, plants and animals.
3.2 3.2
polymerase chain reaction
PCR
method allowing the amplification of a specific DNA sequence using a specific pair of oligonucleotide primers
3.3 3.3
quantitative polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a DNA template (3.4(3.4)) of the number of DNA sequences targeted by
a specific pair of oligonucleotide primers
3.4 3.4
template
DNA sample used to perform polymerase chain reaction (PCR) (3.2 (3.2)) to amplify a specific DNA sequence
3.5 3.5
amplicon
PCR
...

PROJET FINAL
Norme
internationale
ISO/TC 190/SC 4
Qualité du sol — Estimation de
Secrétariat: AFNOR
l’abondance de séquences de gènes
Début de vote:
microbiens par amplification par
2025-08-07
réaction de polymérisation en
Vote clos le:
chaîne quantitative (qPCR) à partir
2025-10-02
d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
from DNA directly extracted from soil
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS,
NOTIFICATION DES DROITS DE PROPRIÉTÉ DONT ILS
AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-MERCIALES,
AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES
PROJETS DE NORMES
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE CONSIDÉRÉS
DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI BILITÉ DE DEVENIR DES
NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTATION
NATIONALE.
Numéro de référence
PROJET FINAL
Norme
internationale
ISO/TC 190/SC 4
Qualité du sol — Estimation de
Secrétariat: AFNOR
l’abondance de séquences de gènes
Début de vote:
microbiens par amplification par
2025-08-07
réaction de polymérisation en
Vote clos le:
chaîne quantitative (qPCR) à partir
2025-10-02
d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
from DNA directly extracted from soil
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS,
NOTIFICATION DES DROITS DE PROPRIÉTÉ DONT ILS
AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
© ISO 2025 INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-MERCIALES,
AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
PROJETS DE NORMES
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE CONSIDÉRÉS
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI BILITÉ DE DEVENIR DES
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
NORMES POUVANT
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTATION
NATIONALE.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse Numéro de référence
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN .4
5.2 Bactéries . .4
5.3 Plasmide .4
5.4 Enzymes .4
5.5 Produits chimiques .4
5.6 Produits pour le milieu de culture bactérienne .5
5.7 Tampons et réactifs .5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) .6
7.1.1 Généralités .6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) .7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) .7
7.1.4 ADN d’isolat bactérien, ADN environnemental, ADN artificiel .7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3).9
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et essai d’inhibition (tâche 2) .10
7.2.1 Généralités .10
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .10
7.2.3 Essai d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) . 13
7.3.1 Généralités . 13
7.3.2 qPCR (tâche 3, étape 6) . 13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) . 13
7.4.1 Généralités . 13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR (tâche 4, étape 7) . 13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol
(tâche 4, étape 8) .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR. 14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Essai interlaboratoires international .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires international relatif à l’évaluation de la qPCR
pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir
d’ADN extrait directement du sol .18
Annexe C (informative) Exemples de systèmes d’amorces bien établis pour une quantification
par qPCR de gènes marqueurs dans des échantillons de sol .31
Bibliographie .34

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité
de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait
pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels
droits de propriété et averti de leur existence.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-
comité SC 4, Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444,
Caractérisation environnementales des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 17601:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— l’Annexe C a été enrichie par des exemples de systèmes de qPCR bien établis permettant de quantifier
certains groupes microbiologiques ou leur fonction.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’info
...