ISO 16140-7:2024
(Main)Microbiology of the food chain — Method validation — Part 7: Protocol for the validation of identification methods of microorganisms
Microbiology of the food chain — Method validation — Part 7: Protocol for the validation of identification methods of microorganisms
This document specifies the general principle and the technical protocol for the validation of identification methods of microorganisms for microbiology in the food chain. As there is no reference method, no method comparison study can be run. Therefore, this document provides a protocol to evaluate the performance characteristics and validate the method workflow using well-defined strains. When required, an additional identification method can be used. This document is applicable to the validation of identification methods of microorganisms that are used for the analysis of isolated colonies from: — products intended for human consumption; — products for feeding animals; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage. Identification methods only validated in accordance with this document cannot be used instead of confirmation described in: — the reference method; — an alternative method validated in accordance with ISO 16140-2; — an alternative method validated in accordance with ISO 16140-6. In these instances, the identification method is validated in accordance with ISO 16140-6 method that is used as a confirmation method. This document is applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other (micro)organisms, which can be determined on a case-by-case basis.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 7: Protocole pour la validation de méthodes d’identification des micro-organismes
Le présent document spécifie le principe général ainsi que le protocole technique pour la validation de méthodes d’identification des micro-organismes dans le domaine de la microbiologie de la chaîne alimentaire. Dans la mesure où il n’existe pas de méthode de référence, une étude de comparaison des méthodes ne peut être entreprise. Par conséquent, le présent document fournit un protocole pour évaluer les caractéristiques de performance et valider le flux de travail de la méthode utilisant des souches bien définies. Si nécessaire, une méthode d’identification supplémentaire peut être utilisée. Le présent document est applicable à la validation de méthodes d’identification des micro-organismes qui sont utilisées pour l’analyse de colonies isolées provenant: — les produits destinés à la consommation humaine; — les produits destinés à l’alimentation animale; — les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits alimentaires; — les échantillons au stade de la production primaire. Les méthodes d'identification validées uniquement conformément au présent document ne peuvent pas être utilisées pour remplacer le mode opératoire de confirmation décrit dans: — la méthode de référence; — une méthode alternative validée conformément à l’ISO 16140-2; — une méthode alternative validée conformément à l’ISO 16140-6. Dans ces cas, la méthode d’identification est validée conformément à la méthode de l’ISO 16140-6 qui est utilisée comme méthode de confirmation. Le présent document est applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles peuvent être applicables à d’autres (micro-)organismes, qui peuvent être déterminés au cas par cas.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 16140-7
First edition
Microbiology of the food chain —
2024-11
Method validation —
Part 7:
Protocol for the validation
of identification methods of
microorganisms
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 7: Protocole pour la validation de méthodes
d’identification des micro-organismes
Reference number
© ISO 2024
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General principles for the validation of identification methods of microorganisms . 4
5 Strains . 4
6 Performance characteristics of an identification method . 5
6.1 General .5
6.2 Description of the concept and limitation(s) of the identification method .5
6.3 Identification reliability of the identification method .6
6.3.1 Number of strains to be tested .6
6.3.2 Selection of the strains .7
6.3.3 Testing of the strains .7
6.3.4 Expression and interpretation of results .8
6.4 Evaluation .9
7 Interlaboratory study .10
7.1 General .10
7.2 Data sets to be obtained .10
7.3 Protocol .11
7.4 Expression of results . .11
7.5 Interpretation and evaluation . 12
Annex A (informative) Guidelines for the validation of methods for the identification
of microorganisms in ecosystems . 14
Annex B (normative) Points to be considered when selecting strains for an identification
reliability study .21
Annex C (informative) Expression, interpretation and evaluation of results.22
Annex D (informative) Illustrations on the validation of methods for the identification
of microorganisms in ecosystems .30
Bibliography .35
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical cooperation
between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 16140 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
0.1 The ISO 16140 series
The ISO 16140 series has been expanded in response to the need for various ways to validate or verify test
methods. It is the successor to ISO 16140:2003. The ISO 16140 series consists of several parts with the
general title, Microbiology of the food chain — Method validation:
— Part 1: Vocabulary;
— Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method;
— Part 3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single
laboratory;
— Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory;
— Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods;
— Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and
typing procedures;
— Part 7: Protocol for the validation of identification methods of microorganisms.
ISO 17468 is a closely linked International Standard, which establishes technical rules for the development
and validation of standardized methods.
In general, two stages are needed before a method can be used in a laboratory.
— The first stage is the validation of the method. Validation is conducted using a study in a single laboratory
followed by an interlaboratory study (see ISO 16140-2, ISO 16140-5, ISO 16140-6 and as described in
this document). In the case when a method is validated within one laboratory (see ISO 16140-4), no
interlaboratory study is conducted.
— The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily
perform a validated method. This is described in ISO 16140-3. Verification is only applicable to methods
that have been validated using an interlaboratory study.
In general, two types of methods are distinguished: reference methods and alternative methods.
A reference method is defined in ISO 16140-1:2016, 2.59, as an “internationally recognized and widely
accepted method”. The note to entry clarifies that “these are ISO standards and standards jointly published
by ISO and CEN or other regional/national standards of equivalent standing”.
In the ISO 16140 series, reference methods include standardized reference (ISO and CEN) methods as
defined in ISO 17468:2023, 3.7, as a “reference method described in a standard”.
An alternative method (method submitted for validation) is defined in ISO 16140-1:2016, 2.4, as a “method
of analysis that detects or quantifies, for a given category of products, the same analyte as is detected or
quantified using the corresponding reference method”. The note to entry clarifies that: “The method can be
proprietary. The term ‘alternative’ is used to refer to the entire ‘test procedure and reaction system’. This
term includes all ingredients, whether material or otherwise, required for implementing the method”.
ISO 16140-4 addresses validation within a single laboratory. The results are therefore only valid for the
laboratory that conducted the study. In this case, verification (as described in ISO 16140-3) is not applicable.
ISO 16140-5 describes protocols for non-proprietary methods where a more rapid validation is required or
when the method to be validated is highly specialized and the number of participating laboratories required
by ISO 16140-2 cannot be reached. ISO 16140-4 and ISO 16140-5 can be used for validation against a
reference method. ISO 16140-4 (regarding qualitative and quantitative methods) and ISO 16140-5 (regarding
quantitative methods only) can also be used for validation without a reference method.
v
The flow chart in Figure 1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above. It
also guides the user in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose of the
study and the remarks given above.
Figure 1 — Flow chart for application of ISO 16140-2 to ISO 16140-5
NOTE 1 In this document, the words “category”, “type” and/or “item” are sometimes combined with “(food)” to
improve readability. However, the word “(food)” is interchangeable with “(feed)” and other areas of the food chain as
mentioned in Clause 1.
ISO 16140-6 and this document (ISO 16140-7) are somewhat different from the other parts in the ISO 16140
series in that they relate to very specific situations.
ISO 16140-6 is restricted to the confirmation procedure of a method to be validated [e.g. the biochemical
confirmation of Enterobacteriaceae (see ISO 21528-2)]. The confirmation procedure advances a suspected
(presumptive) result to a confirmed positive result. The validation of alternative typing techniques
(e.g. serotyping of Salmonella) is also covered by ISO 16140-6. The validation study in ISO 16140-6 clearly
specifies the selective agar(s) from which strains can be confirmed using the alternative confirmation
method. If successfully validated, the alternative confirmation method can only be used if strains are
recovered on an agar that was used and was shown to be acceptable within the validation study. Figure 2
shows the possibilities where an alternative confirmation method validated in accordance with ISO 16140-6
can be applied (see text in the boxes).
vi
Figure 2 — Use of validated alternative confirmation methods (see ISO 16140-6)
EXAMPLE 1 An example application of a validated alternative confirmation method is as follows.
An alternative confirmation method based on ELISA has been validated to replace the biochemical confirmation for
Salmonella as described in ISO 6579-1. In the validation study, XLD (mandatory agar in accordance with ISO 6579-1)
plus BGA and a specified chromogenic agar (two optional agars for second plating in accordance with ISO 6579-1) were
used as the agars to start the confirmation. The validated confirmation method can be used to replace the biochemical
confirmation under the following conditions:
— by laboratories using ISO 6579-1; or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers to ISO 6579-1 for confirmation; or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that starts the confirmation from XLD and/or
BGA agar and/or the specified chromogenic agar.
The validated confirmation method cannot be used under the following conditions:
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to agars other than those
included in the validation to start the confirmation (e.g. Hektoen agar and SS agar only); or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to a confirmation procedure
that does not require isolation on agar.
This document (ISO 16140-7) addresses the validation of identification procedures (e.g. molecular
identification using multiplex PCR or DNA sequencing or mass spectrometry). This document differs from
the other parts in the ISO 16140 series, as it is intended for microbial identification for which there is no
reference method and, therefore, it is not possible to run a method comparison study. The validation study in
this document specifies the identification method principle, the identification database and algorithm when
appropriate, and the agar(s) from which strains can be identified. If properly characterized and successfully
validated, the identification method can only be validly used on strains recovered on the agars covered and
shown to have been acceptable within the validation study.
NOTE 2 Whole-genome sequencing (WGS) in accordance with ISO 23418 will eventually be a reference method
for all microorganisms, but the implementation of this technique is still at an early stage. Therefore, the use of WGS
cannot currently be requested as a reference method for a large panel of strains.
Figure 3 shows the possibilities where an alternative confirmation method validated in accordance with
ISO 16140-6 and an alternative identification method validated in accordance with this document can be
applied within a reference method or an ISO 16140-2 validated detection or enumeration method. The result
provided by the ISO 16140-7 validated method can be considered as additional information on the identity
of the tested colony(ies); this result cannot be taken as a confirmation result. When there is a discrepancy
vii
between the results of the ISO 16140-6 validated method and the ISO 16140-7 validated method, a root
cause analysis is conducted. An ISO 16140-7 validated method can also be used to identify colonies within
methods that do not require a confirmation step.
Figure 3 — Flow chart for the application of ISO 16140-6 and this document for
the confirmation and identification of colonies within a reference method or an
ISO 16140-2 validated detection or enumeration method
If the identification method is also validated in accordance with ISO 16140-6, the same method can be used
for both confirmation and identification.
When a confirmation method is used, it is possible to apply an identification method validated in accordance
with this document for further identification.
EXAMPLE 2 An alternative confirmation method of Campylobacter genus can be validated in accordance with
ISO 16140-6 and compared to the mandatory confirmation procedure at the genus level described in ISO 10272-1.
The identification at the Campylobacter species level is optional in ISO 10272-1 and ISO 10272-2 and is therefore not
mandatory. In this instance, an identification method at the Campylobacter species level can be validated in accordance
with this document. If the method is validated by ISO 16140-6 and this document, it can be used for both confirmation
and identification purposes.
0.2 Validation and verification of identification methods of microorganisms
The procedure described in this document is intended for validation of identification methods of
microorganisms. This procedure comprises two parts: a performance characteristics study and an
interlaboratory study.
The procedure for validation of identification methods of microorganisms in a single laboratory is described
in ISO 16140-4. The procedure for verification of identification methods of microorganisms in a single
laboratory is described in ISO 16140-3.
viii
International Standard ISO 16140-7:2024(en)
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 7:
Protocol for the validation of identification methods of
microorganisms
1 Scope
This document specifies the general principle and the technical protocol for the validation of identification
methods of microorganisms for microbiology in the food chain. As there is no reference method, no method
comparison study can be run. Therefore, this document provides a protocol to evaluate the performance
characteristics and validate the method workflow using well-defined strains. When required, an additional
identification method can be used.
This document is applicable to the validation of identification methods of microorganisms that are used for
the analysis of isolated colonies from:
— products intended for human consumption;
— products for feeding animals;
— environmental samples in the area of food and feed production and handling;
— samples from the primary production stage.
Identification methods only validated in accordance with this document cannot be used instead of
confirmation described in:
— the reference method;
— an alternative method validated in accordance with ISO 16140-2;
— an alternative method validated in accordance with ISO 16140-6.
In these instances, the identification method is validated in accordance with ISO 16140-6 method that is
used as a confirmation method.
This document is applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other (micro)organisms,
which can be determined on a case-by-case basis.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16140-1, Microbiology of the food chain — Method validation — Part 1: Vocabulary
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16140-1 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
acceptability limit
AL
maximum acceptable proportion of deviations between the reference identities (or if not known, the
accepted reference values) of the strains or specimens and the corresponding identification results obtained
when applying the operating procedure of the candidate identification method
Note 1 to entry: In the context of this document, the reference value can be the assigned identity of the strain.
3.2
agreement
identification agreement
method under validation study provides the same identification result as the assigned, i.e. original,
identification of the tested strain
3.3
assigned identity
result of the microorganism identification displaying generally accepted molecular and/or biochemical
characteristics
[13]
EXAMPLE Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria .
3.4
comparison algorithm
defined calculation rules used to compare the profile of the analysed strain to the database
3.5
confirmation procedure
confirmation test
procedure or test which is carried out to verify a presumptive result
Note 1 to entry: Not all methods have a confirmation procedure
Note 2 to entry: A confirmation test can provide a positive or negative result, without yielding the identity of the
analyte.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.17, modified — Note 2 has been included.]
3.6
database
library
collection of data categories and concept entry structure of an identification database
Note 1 to entry: An identification database usually gathers the phenotypic or molecular data information of several
strains from the same species or genus.
Note 2 to entry: Some identification methods can have a restricted scope and do not imply a database (e.g. multiplex
PCR assay).
3.7
deviation
identification deviation
method under validation study does not provide the same identification result as the assigned, i.e. original,
identification of the tested strain
3.8
group
group of microbial ecosystems
specimens processed in a similar way, with similar intrinsic characteristics and a similar microbial ecology
EXAMPLE Enrichment broths.
3.9
homology
score
identity between the profile of the analysed strain and the entry(ies) in the database
Note 1 to entry: This is normally measured as % or with score value(s).
Note 2 to entry: For select identification methods (e.g. microarray), a homology score may not be obtained.
3.10
identification method
method submitted for validation
method of analysis that provides the name (identity) of the microorganism (e.g. species or higher taxonomy
ranking level)
Note 1 to entry: The method can be non-proprietary or proprietary.
Note 2 to entry: The methods can be based on various principles (e.g. phenotypic and molecular principles).
Note 3 to entry: The identification of microorganisms can help for example in determining whether it is a safety
or spoilage concern, or is a specific technological or probiotic strain, or is likely to be resistant to an inactivation
treatment.
3.11
identification procedure
identification test
procedure or test yielding the identity of the analyte (e.g. species or higher taxonomy ranking level)
3.12
level of detection
LOD
x
relative concentration of the measured analyte in proportion to the total count of the specimen, obtained by
a given measurement procedure, for which the probability of detection is x
EXAMPLE LOD is the level of detection for which 50 % of tests give a positive result.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.35, modified — In the definition, “relative” and “in proportion to the total
count of the specimen” have been added and the Note 1 to entry has been deleted.]
3.13
profile
set of characteristics that identify or are used to identify a strain
Note 1 to entry: The profile can be phenotypic (e.g. biochemical or serological) and/or molecular (e.g. DNA fingerprint,
DNA sequence or mass spectra).
3.14
reliability
identification reliability
closeness of agreement between an identification result and the assigned identity of the tested strain
Note 1 to entry: The concept “identification reliability” is related to the identity of the analyte, i.e. genus or/and species
names(s).
Note 2 to entry: “Identification reliability” is sometimes understood as closeness of agreement with the identification
result that are being attributed to the identity of the strain given by another identification method.
3.15
risk of non-identification
ratio of the probability of getting no identification result within a specified set of strains included in the
scope of validation
Note 1 to entry: This does not apply to misidentification.
3.16
scope of validation
database content and version, culture media or group of microbial ecosystems and comparison algorithm
for which a validated method for the identification of microorganisms can be used satisfactorily
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.70 modified — In the definition, “analytes, matrices, and concentrations”
has been replaced by “database content and version, culture media or group of microbial ecosystems and
comparison algorithm”.]
4 General principles for the validation of identification methods of microorganisms
The validation protocol comprises two phases:
— a performance characteristics study;
— an interlaboratory study.
NOTE 1 For proprietary methods, the validation study is conducted by an organizing laboratory (see
ISO 16140-1:2016, 2.45).
NOTE 2 It is possible, if relevant, to include inclusivity or exclusivity data obtained in an ISO 16140-2 or an
ISO 16140-6 validation study into a study related to this document.
NOTE 3 As there is no reference identification method, there is no method comparison study.
The technical rules for performing the method performance characteristics study and the interlaboratory
study are given in Clauses 6 and 7. An extended set of strains from a non-selective agar or a selective agar
when appropriate (e.g. yeasts and moulds) will be tested for both parts.
Where appropriate, the validation protocol shall also specify the selective media from which strains can be
identified using the identification method. A specified number of strains shall be tested.
NOTE 4 The term “agar” is often referred to as “solid culture medium”.
NOTE 5 Other applications of identification methods are possible (e.g. identification of microorganisms in an
ecosystem), see Annex A for further information.
NOTE 6 The identification procedure can be ensured by the collaboration of multiple laboratories. For instance, a
first laboratory can isolate the strains and run the sample preparation such as DNA extraction and sequencing; the
generated data can be analysed by comparison to the database held and managed by a second laboratory. In such a
case, during the interlaboratory study, multiple collaborators will be involved in the sample preparation and will send
the results for analysis to the laboratory managing the identification data interpretation.
5 Strains
The pure strains used for determining the identification reliability of the method shall be well-characterized
in line with the purpose of the validation study. When necessary, the identification information provided by
a second identification is used to evaluate the discrepancies between the results of the tested identification
method and the assigned identity of the strain.
NOTE 1 National, regional or international reference laboratories can be contacted during such investigations.
NOTE 2 Well-characterized strains are strains that can be obtained from national/international culture collections,
or ones that have been obtained locally and have been previously identified and given the same identity using usually
two or more identification methods that are based on dissimilar principles.
NOTE 3 When appropriate, select strains with available WGS data in accordance with ISO 23418.
6 Performance characteristics of an identification method
6.1 General
The performance characteristics study is the part of the validation that is performed in one laboratory.
It consists of a description of the concept and limitation(s) of the identification method, and an identification
reliability study of the method. The results are then compared to those of the assigned identities of the
tested set of strains.
6.2 Description of the concept and limitation(s) of the identification method
The method characteristics described in Table 1 shall be carefully described in the method protocol (e.g.
standard operation procedure, instructions for use) to enable proper use of the identification method by the
end-user.
Table 1 — Essential components of the performance characteristics study
Characteristics Detailed information
Scope of validation Database description including name, version and content
Culture media
Microorganism name or type (e.g. bacteria, yeast, moulds, lactic acid bacteria,
Listeriaceae)
Comparison algorithm version
Identification method Description of the strain profile/sequence and instrument signal acquisition used for
principle identification of microorganisms
Database content List of the genera and species in the database version used in the validation study
Concept of the database Description of the types of signal profiles in the database, e.g. one unique profile select-
ed as a representative for various strains of the same species or several signal profiles
of various strains of the same species
Strains per species and Number of strains per species and genera
genera in database
A minimum of 5 strains is required to claim a species in the database content
Limitations List of the closely related species that are not differentiated by the identification
method, size of the database
Comparison algorithm Calculation of the result reporting, e.g. comparison of the instrument signal profile of
the analysed strain to each single profile in the database or comparison of the profile of
the analysed strain to unique average profiles for each species of the database.
Result reporting Description of the homology concept used to assess the identification results with high
confidence or low confidence
Strain preparation and Description of the strain preparation and method workflow, particularly when
troubleshooting obtaining homology result of low confidence or when no identification result is
generated
In some very specific cases, the minimum number of strains per species in the database can be lower than
the required 5 strains due to the lack of available strains. There should be a disclaimer in the database
content for strains that do not meet the minimum requirement.
If the identification method does not imply a database (e.g. multiplex PCR assay), the description of the
concept and limitation(s) of the identification method should be restricted to the scope of validation,
the identification method principle, the limitations, the result reporting, the strain preparation and
troubleshooting.
6.3 Identification reliability of the identification method
6.3.1 Number of strains to be tested
The set of strains to be tested depends on the database content and the scope of the validation. Select, as
much as possible, one strain per species to ensure that at least 25 % of genera and 10 % of species contained
in the database are tested. However, a minimum and a maximum number of strains to be tested has been
specified at, respectively, 250 strains and 1 000 strains. For restricted database content (e.g. 25 genera and
200 species), test all the genera and species.
Figure 4 provides examples of how to determine the appropriate number of strains to be tested.
Figure 4 — Examples on how to determine the number of strains to be tested
Pure cultures from a non-selective agar of all selected strains shall be tested by the identification method.
NOTE 1 Non-selective agars (e.g. TSA) enable the recovery of a broad range of microorganisms and can favour the
recovery of some specified groups of microorganisms. For microorganisms, for which non-selective agars are not
known or are not supported by corresponding standardized reference methods for the isolation of the respective
microorganism, only selective agars can be used instead.
If the scope of the validation study also includes selective agars, refer to Table 2 for the number of relevant
genera and species to be tested for each selective agar included in the scope.
NOTE 2 Selective agars can enable the recovery of microorganisms from specific clades, (i) family, (ii) genus
or group of species (e.g. Bacillus cereus group). In this document, “group of species ” is substituted with “genus” to
improve readability. However, the word “genus” is interchangeable with “group of species”.
Table 2 — Number of strains to be tested for each of the selective agars included in the scope
Taxonomy level of the strains recovered Number of strains to be tested for each of the selective agars
on the tested selective agars included in the scope
Family 100 strains, from as many different genera and species as possible,
including strains from multiple families that can grow on the selec-
tive agar
Genus 50 strains, from as many different species as possible, including
strains from multiple genera that can grow on the selective agar
Species 25 strains that can grow on the selective agar
Sub-species, types 25 strains that can grow on the selective agar
For a method with a restricted scope (e.g. multiplex PCR assay), it is recommended to test a relevant panel of
strains that should not produce identification results (negative control strains) as expected by the scope of
the method (see the example in Clause C.4).
6.3.2 Selection of the strains
A broad range of strains shall be used. Criteria used for selecting test strains shall be in accordance
with Annex B. The strains selected should take into account the measurement principle (e.g. phenotypic
or molecular based) and the database content of the identification method. Different measurement
principles can require the use of panels of different test strains, representing the diversity of the studied
microorganism(s). As much as possible, strains used in the development of the database should not be used
in the validation of the identification method unless availability of strains is limited. In this case, disclosure
shall be included in the validation study report. The rationale for the choice of the strains and their
characteristics shall be included in the validation study report (e.g. coverage of the database, closely related
species, recent changes in taxonomy).
Select strains from species able to be recovered on the test agar(s). For selective agars, select test strains
from multiple families or genera.
Each strain shall be characterized in sufficient detail for its assigned identity to be known using relevant
phenotypic or molecular tests. The method or the method principle used for the identification shall be known.
Strains should preferably have been isolated from foods, feed, the food-processing environment or from
primary production; depending on the scope of the validation. However, clinical strains can also be used.
The original source of all strains should be known, and they should be held in a local (e.g. expert laboratory),
national or international culture collection to enable them to be used in future testing if required. See
ISO 11133 for guidance on the local maintenance of stock cultures.
Results generated by a specialized reference laboratory, using an appropriate identification method, can
be used if the laboratory performing the validation study is not able to perform the identification of rare
strains.
6.3.3 Testing of the strains
Pure cultures of all selected strains shall be tested with the identification method from a non-selective agar
and the selected selective agars (if any) included in the scope of validation.
In case of discrepancies between the assigned identity of a tested strain and the result provided by the
identification method evaluated, run a root cause analysis:
— Repeat the identification of the tested strain with both, the method, or the method principle, used to
assign the identification of the strain and the identification method evaluated during the validation
study. If the discrepancy is confirmed, identify the strain with a third method.
— The third appropriate method shall preferably use different characteristics than the method used to
initially assign the identity of the strain and the identification method being validated.
6.3.4 Expression and interpretation of results
Tabulate the results from strains grown on non-selective (and selective agars) as in Table 3 and include the
final interpretation for the identification deviations in accordance with Table 4. The outcome, preferably
tabulated, with an explanation, shall be included in the validation study report.
A deviation at a higher taxonomy ranking level is also regarded as a deviation at a lower taxonomy ranking
level. For instance, since the genus is a higher taxonomy ranking level than species, a deviation at the genus
level is also regarded as a deviation at the species level.
If the third method used for the root cause analysis matches the result of the assigned identity and confirms
the identification deviation, then report the final interpretation as an identification reliability deviation
(IRD) in Table 4.
The identification reliability deviation (IRD) should be adapted to the scope of the method. For instance,
IRD or IRD specify if the IRD is at the genus or species levels and are given as examples. If the
genus species
third method used for the root cause analysis matches the identification result provided by the method
evaluated and does not confirm therefore the identification deviation, then report the final interpretation as
an identification agreement (IA) in Table 4.
If the identification results differ with the three methods, it is most likely that the tested strain cannot be
identified with the currently available method principles. This result should be reported but not included in
the data interpretation.
NOTE 1 Detailed examples are given in Annex C (expression, interpretation and evaluation of results).
NOTE 2 In some specific cases, the method under validation is able to identify strains at a lower taxonomy level
than the method(s) used for comparison. The reliability will be first assessed regarding the taxonomy level shared
by the methods used in the validation study. Additional information will be considered to evaluate the reliability
of the identification at a lower taxonomy level given by the method under validation, e.g. whole genome sequencing
as described in ISO 23418 or any relevant fingerprinting or sequences. These additional data will be interpreted as
described in Table 4.
Table 3 — Results of the identification reliability study
Identity of the strain Identity of the
Agar(s) used Interpretation
Tested strain by the
to recover of results
Assigned Identification method, or
strain method under
the strain (IA/ID/N )
identity identification method principle a 0
validation
Etc.
Key
IA: identification agreement, ID: identification deviation, N : no identification.
a
Include results with no identification.
NOTE Assigned identity of the individual strains are, as a minimum: the name of the strain, (culture) collection number and
origin of the strain. Other available characteristics can be added as well.
Table 4 — Interpretation of the identification deviations of the identification reliability study
Identity of the strain by a third method Interpretation
Identity of the strain
Tested Assigned using a different principle of results (IA/
by the method under
strain identity IRD or
a genus
validation
Method principle Identity of the strain
IRD )
species
Etc.
Key
IA: Identification agreement, IRD : identification reliability deviation at the genus level, IRD : identification reliability
genus species
deviation at the species level.
a
Include results with no identification.
NOTE Assigned identity of the individual strains are as a minimum: the name of the strain, (culture) collection number and
origin of the strain. Other available characteristics can be added as well.
6.4 Evaluation
Summarize the results of the identification reliability study for each of the tested agars, as in Table 5 (in
total numbers of N , IA and IRD found), based on the interpretations in accordance with Table 3 (results
of the identification reliability study) and Table 4 (interpretation for the identification deviations of the
identification reliability study).
Table 5 — Summary of the results in the identification reliability study
Number of
Tested agar
Strains (N) IA N IRD IRD
0 genus species
x
Etc.
Key
N: number of strains, IA: identification agreement, N : number of non-identified strains, IRD : identification reliability
0 genus
deviation at the genus level, IRD : identification reliability deviation at the species level
species
Calcul
...
Norme
internationale
ISO 16140-7
Première édition
Microbiologie de la chaîne
2024-11
alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 7:
Protocole pour la validation de
méthodes d’identification des
micro-organismes
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 7: Protocol for the validation of identification methods of
microorganisms
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principes généraux applicables à la validation de méthodes d’identification des micro-
organismes . 4
5 Souches . 5
6 Caractéristiques de performance d’une méthode d’identification . 5
6.1 Généralités .5
6.2 Description du concept et de la ou des limites de la méthode d’identification .5
6.3 Fiabilité d’identification de la méthode d’identification .6
6.3.1 Nombre de souches à soumettre à essai .6
6.3.2 Sélection des souches .8
6.3.3 Essais des souches.8
6.3.4 Expression et interprétation des résultats .8
6.4 Évaluation .10
7 Étude interlaboratoires .11
7.1 Généralités .11
7.2 Jeux de données à obtenir .11
7.3 Protocole . 12
7.4 Expression des résultats . . 12
7.5 Interprétation et évaluation . 13
Annexe A (informative) Lignes directrices relatives à la validation des méthodes pour
l’identification des micro-organismes présents dans les écosystèmes .15
Annexe B (normative) Aspects à prendre en compte lors de la sélection des souches pour une
étude de fiabilité d’identification .23
Annexe C (informative) Expression, interprétation et évaluation des résultats .24
Annexe D (informative) Illustrations relatives à la validation des méthodes d’identification de
micro-organismes dans les écosystèmes .32
Bibliographie .37
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n'avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire,
du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO
et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
0.1 Série ISO 16140
La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la
validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140
comprend plusieurs parties sous le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire;
— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode
de référence;
— Partie 3: Protocole pour la vérification dans un seul laboratoire de méthodes de référence et de méthodes
alternatives validées;
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;
— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel;
— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage;
— Partie 7: Protocole pour la validation de méthodes d’identification des micro-organismes.
L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le
développement et la validation de méthodes normalisées.
En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire:
— la première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans un seul
laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir l’ISO 16140-2, l’ISO 16140-5, l’ISO 16140-6 et le
présent document). Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (voir l’ISO 16140-4),
aucune étude interlaboratoires n’est effectuée;
— la seconde étape est la vérification de la méthode, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il
peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3.
La vérification est uniquement applicable aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude
interlaboratoires.
On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.
Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode reconnue
internationalement et largement acceptée». La note à l’article précise qu’«il s’agit des normes ISO et des
normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/nationales de statut
équivalent».
Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées (ISO et
CEN) telles que définies dans l’ISO 17468:2023, 3.7, en tant que «méthode de référence décrite dans une norme».
Une méthode alternative (méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4, en tant
que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits donnée,
le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante». La note à
l’article précise que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif «alternatif» se réfère à la totalité du
«mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments nécessaires à la
mise en œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.»
L’ISO 16140-4 traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les résultats sont uniquement
valides pour le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification (comme décrit dans
l’ISO 16140-3) n’est applicable. L’ISO 16140-5 décrit les protocoles applicables dans le cas de méthodes
non commerciales nécessitant une validation plus rapide ou lorsque la méthode à valider est hautement
v
spécialisée et que le nombre de laboratoires participants requis par l’ISO 16140-2 ne peut pas être atteint.
L’ISO 16140-4 et l’ISO 16140-5 peuvent être utilisées pour la validation avec méthode de référence.
L’ISO 16140-4 (concernant les méthodes qualitatives et quantitatives) et l’ISO 16140-5 (concernant les
méthodes quantitatives uniquement) peuvent également être utilisées pour la validation sans méthode de
référence.
Le logigramme de la Figure 1 donne une vue d’ensemble des relations entre les différentes parties
susmentionnées. Il aide également l’utilisateur à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140, en tenant
compte de l’objectif de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus.
Figure 1 — Logigramme relatif à l’application des ISO 16140-2 à ISO 16140-5
NOTE 1 Dans le présent document, les termes «catégorie», «type» et/ou «élément» sont parfois associés au terme
«(aliment)» pour une meilleure compréhension. Cependant, le terme «(aliment)» peut être remplacé par «(aliment pour
animaux)» et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés à l’Article 1.
L’ISO 16140-6 et le présent document (ISO 16140-7) sont quelque peu différents des autres parties de la
série ISO 16140 car ils concernent des situations très spécifiques.
L’ISO 16140-6 est limitée au mode opératoire de confirmation d’une méthode à valider [par exemple,
la confirmation biochimique des Enterobacteriaceae (voir l’ISO 21528-2)]. Le mode opératoire de confirmation
permet de passer d’un résultat suspecté (présomptif) à un résultat positif confirmé. La validation des
méthodes alternatives de typage (par exemple, sérotypage de Salmonella) est également couverte par
l’ISO 16140-6. L’étude de validation de l’ISO 16140-6 spécifie clairement la ou les géloses sélectives à partir
desquelles les souches peuvent être confirmées en utilisant la méthode alternative de confirmation. Lorsque
la méthode alternative de confirmation est validée, elle ne peut être appliquée que si les souches sont
cultivées sur une gélose utilisée et jugée acceptable lors de l’étude de validation. La Figure 2 illustre les
situations dans lesquelles une méthode alternative de confirmation validée conformément à l’ISO 16140-6
peut être appliquée (voir le texte dans les cases).
vi
Figure 2 — Utilisation de méthodes alternatives de confirmation validées (voir l’ISO 16140-6)
EXEMPLE 1 Voici un exemple d’application d’une méthode alternative de confirmation validée.
Une méthode alternative de confirmation par ELISA a été validée pour remplacer la confirmation biochimique de
Salmonella décrite dans l’ISO 6579-1. Lors de l’étude de validation, la gélose XLD (gélose obligatoire conformément à
l’ISO 6579-1) ainsi que la gélose BGA et une gélose chromogène spécifiée (deux géloses facultatives pour le deuxième
ensemencement conformément à l’ISO 6579-1) ont été utilisées pour commencer la confirmation. La méthode de
confirmation validée peut être utilisée pour remplacer la confirmation biochimique dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires appliquant l’ISO 6579-1; ou
— par des laboratoires appliquant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant référence à l’ISO 6579-1
pour la confirmation; ou
— par des laboratoires appliquant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 qui commence la confirmation
à partir de la gélose XLD et/ou la gélose BGA et/ou la gélose chromogène spécifiée.
La méthode de confirmation validée ne peut pas être utilisée dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires appliquant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement référence
à des géloses autres que celles incluses dans la validation pour commencer la confirmation (par exemple, la gélose
Hektoen et la gélose SS uniquement); ou
— par des laboratoires appliquant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement référence
à un mode opératoire de confirmation ne nécessitant pas d’isolement sur gélose.
Le présent document (ISO 16140-7) concerne la validation des modes opératoires d’identification
(par exemple, identification moléculaire par PCR multiplex, séquençage ADN ou spectrométrie de
masse). Le présent document diffère des autres parties de la série ISO 16140 car il s’applique au cas d’une
identification microbienne pour laquelle il n’existe pas de méthode de référence et où il est donc impossible
d’effectuer une étude de comparaison des méthodes. L’étude de validation décrite dans le présent document
spécifie le principe de la méthode d’identification, la base de données et l’algorithme d’identification s’il y
a lieu, et la ou les géloses à partir desquelles les souches peuvent être identifiées. Si elle est correctement
caractérisée et validée, la méthode d’identification ne peut être utilisée avec fiabilité que sur les souches
récupérées sur les géloses concernées et jugées acceptables lors de l’étude de validation.
NOTE 2 Même si le séquençage de génome entier (WGS) conformément à l’ISO 23418 sera probablement une
méthode de référence pour tous les micro-organismes, la mise en œuvre de cette technique n’en est qu’à ses débuts.
L’utilisation du WGS ne peut donc pas pour l’heure être envisagée en tant que méthode de référence pour un large
panel de souches.
vii
La Figure 3 illustre les possibilités pour qu’une méthode alternative de confirmation validée conformément
à l’ISO 16140-6 et une méthode alternative d’identification validée conformément au présent document
puissent être appliquées dans une méthode de référence ou dans une méthode de détection ou de
dénombrement validée selon l’ISO 16140-2. Le résultat fourni par la méthode validée selon l’ISO 16140-7 peut
être considéré comme un supplément d’informations concernant l’identité de la ou des colonies soumises
à essai; ce résultat ne peut pas être pris comme résultat de confirmation. En cas de divergence entre les
résultats de la méthode validée selon l’ISO 16140-6 et ceux de la méthode validée selon l’ISO 16140-7, une
analyse des causes est nécessaire. Une méthode validée selon l’ISO 16140-7 peut être également utilisée
pour identifier les colonies dans les méthodes qui ne nécessitent pas d’étape de confirmation.
Figure 3 — Logigramme relatif à l’application de l’ISO 16140-6 et du présent document pour
la confirmation et l’identification des colonies avec une méthode de référence ou avec une méthode
de détection ou de dénombrement validée selon l’ISO 16140-2
Si la méthode d’identification est également validée conformément à l’ISO 16140-6, cette même méthode
peut être utilisée à la fois pour la confirmation et l’identification.
Lorsqu’une méthode de confirmation est utilisée, il est possible d’appliquer une méthode d’identification
validée conformément au présent document pour une identification complémentaire.
EXEMPLE 2 Une méthode alternative de confirmation du genre Campylobacter peut être validée conformément à
l’ISO 16140-6 et comparée au mode opératoire de confirmation obligatoire au niveau du genre décrit dans l’ISO 10272-1.
L’identification au niveau de l’espèce de Campylobacter est facultative dans l’ISO 10272-1 et l’ISO 10272-2 et n’est donc
pas obligatoire. Dans ce cas, une méthode d’identification au niveau de l’espèce de Campylobacter peut être validée
conformément au présent document. Si la méthode est validée par l’ISO 16140-6 et le présent document, elle peut être
utilisée à la fois pour la confirmation et l’identification.
0.2 Validation et vérification des méthodes d’identification des micro-organismes
Le mode opératoire décrit dans le présent document est destiné à la validation des méthodes d’identification
des micro-organismes. Ce mode opératoire comprend deux parties: une étude des caractéristiques de
performance et une étude interlaboratoires.
Le mode opératoire de validation des méthodes d’identification des micro-organismes dans un seul
laboratoire est décrit dans l’ISO 16140-4. Le mode opératoire de vérification des méthodes d’identification
des micro-organismes dans un seul laboratoire est décrit dans l’ISO 16140-3.
viii
Norme internationale ISO 16140-7:2024(fr)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 7:
Protocole pour la validation de méthodes d’identification des
micro-organismes
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie le principe général ainsi que le protocole technique pour la validation de
méthodes d’identification des micro-organismes dans le domaine de la microbiologie de la chaîne alimentaire.
Dans la mesure où il n’existe pas de méthode de référence, une étude de comparaison des méthodes ne peut
être entreprise. Par conséquent, le présent document fournit un protocole pour évaluer les caractéristiques
de performance et valider le flux de travail de la méthode utilisant des souches bien définies. Si nécessaire,
une méthode d’identification supplémentaire peut être utilisée.
Le présent document est applicable à la validation de méthodes d’identification des micro-organismes qui
sont utilisées pour l’analyse de colonies isolées provenant:
— les produits destinés à la consommation humaine;
— les produits destinés à l’alimentation animale;
— les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits
alimentaires;
— les échantillons au stade de la production primaire.
Les méthodes d'identification validées uniquement conformément au présent document ne peuvent pas être
utilisées pour remplacer le mode opératoire de confirmation décrit dans:
— la méthode de référence;
— une méthode alternative validée conformément à l’ISO 16140-2;
— une méthode alternative validée conformément à l’ISO 16140-6.
Dans ces cas, la méthode d’identification est validée conformément à la méthode de l’ISO 16140-6 qui est
utilisée comme méthode de confirmation.
Le présent document est applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles peuvent être
applicables à d’autres (micro-)organismes, qui peuvent être déterminés au cas par cas.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16140-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 1: Vocabulaire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16140-1 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
limite d’acceptabilité
AL
proportion maximale acceptable de divergences entre les identités de référence (ou si celles-ci ne sont pas
connues, les valeurs de référence acceptées) des souches ou des spécimens et les résultats d’identification
correspondants obtenus par application du mode opératoire de la méthode d’identification candidate
Note 1 à l'article: Dans le contexte du présent document, la valeur de référence peut être l’identité assignée de la souche.
3.2
accord
accord d’identification
méthode qui, dans le cadre d’une étude de validation, fournit le même résultat d’identification que l’identité
assignée, c’est-à-dire originale, de la souche soumise à essai
3.3
identité assignée
résultat de l’identification du micro-organisme présentant des caractéristiques moléculaires et/ou
biochimiques généralement reconnues
[13]
EXEMPLE Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria .
3.4
algorithme de comparaison
règles de calcul définies utilisées pour comparer le profil de la souche analysée par rapport à la base de données
3.5
mode opératoire de confirmation
essai de confirmation
mode opératoire ou essai visant à vérifier un résultat présomptif
Note 1 à l'article: Les méthodes ne disposent pas toutes d’un mode opératoire de confirmation.
Note 2 à l'article: Un essai de confirmation peut fournir un résultat positif ou négatif sans pour autant fournir l’identité
de l’analyte.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.17, modifié — La Note 2 a été ajoutée.]
3.6
base de données
librairie
ensemble de catégories de données et structure des données d’entrée d’une base de données d’identification
Note 1 à l'article: Une base de données d’identification regroupe généralement les informations phénotypiques ou
moléculaires de plusieurs souches de la même espèce ou du même genre.
Note 2 à l'article: Certaines méthodes d’identification peuvent avoir un domaine d’application restreint et ne pas
impliquer de base de données (par exemple, un essai PCR multiplex).
3.7
déviation
déviation d’identification
méthode qui, dans le cadre d’une étude de validation, ne fournit pas le même résultat d’identification que
l’identité assignée, c’est-à-dire originale, de la souche soumise à essai
3.8
groupe
groupe d’écosystèmes microbiens
spécimens traités de manière similaire, ayant des caractéristiques intrinsèques similaires et une écologie
microbienne similaire
EXEMPLE Bouillons d’enrichissement.
3.9
homologie
score
identité entre le profil de la souche analysée et l’entrée ou les entrées dans la base de données
Note 1 à l'article: Elle est normalement mesurée en % ou avec des scores.
Note 2 à l'article: Pour les méthodes d’identification sélectionnées (par exemple, puce ADN), un score d’homologie peut
ne pas être obtenu.
3.10
méthode d’identification
méthode soumise à validation
méthode d’analyse qui fournit le nom (l’identité) du micro-organisme (par exemple, l’espèce ou le rang
taxonomique supérieur)
Note 1 à l'article: La méthode peut être une méthode commerciale ou non.
Note 2 à l'article: Les méthodes peuvent reposer sur plusieurs principes (par exemple, principes phénotypiques et
moléculaires).
Note 3 à l'article: L’identification des micro-organismes peut par exemple aider à déterminer s’il s’agit d’un risque
sanitaire ou de contamination, de la présence d’une souche spécifique utilisée en biotechnologie ou d’un probiotique,
ou de la propension à la résistance à un traitement d’inactivation.
3.11
mode opératoire d’identification
essai d’identification
mode opératoire ou essai qui fournit l’identité de l’analyte (par exemple, l’espèce ou le rang taxonomique
supérieur)
3.12
niveau de détection
LOD
x
concentration relative en analyte mesurée en proportion de la flore mésophile aérobie du spécimen,
obtenue par un mode opératoire de mesure donné, dont la probabilité de détection est x
EXEMPLE LOD est le niveau de détection auquel 50 % des essais donnent un résultat positif.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.35, modifié — Dans la définition, «relative» et «en proportion de la flore
mésophile du spécimen» ont été ajoutés et la Note 1 à l’article a été supprimée.]
3.13
profil
ensemble de caractéristiques qui identifient ou servent à identifier une souche
Note 1 à l'article: Le profil peut être phénotypique (par exemple, biochimique ou sérologique) et/ou moléculaire
(par exemple, empreinte génétique, séquence d’ADN ou spectres de masse).
3.14
fiabilité
fiabilité d’identification
étroitesse de l’accord entre un résultat d’identification et l’identité assignée de la souche soumise à essai
Note 1 à l'article: Le concept de «fiabilité d’identification» est lié à l’identité de l’analyte, c’est-à-dire aux noms de genre
et/ou d’espèce.
Note 2 à l'article: La «fiabilité d’identification» est parfois interprétée comme l’étroitesse de l’accord avec le résultat
d’identification qui est attribué à l’identité de la souche donnée par une autre méthode d’identification.
3.15
risque de non-identification
rapport de la probabilité de ne pas obtenir de résultat d’identification dans un ensemble spécifié de souches
incluses dans le domaine d’application de la validation
Note 1 à l'article: Cela ne s’applique pas à l’erreur d’identification.
3.16
domaine d’application de la validation
contenu et version d’une base de données, milieu de culture ou groupe d’écosystèmes microbiens et
algorithme de comparaison pour lesquels une méthode d’identification des micro-organismes validée peut
être utilisée de manière satisfaisante
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.70 modifié — Dans la définition, «analytes, matrices et concentrations»
a été remplacé par «contenu et version d’une base de données, milieu de culture ou groupe d’écosystèmes
microbiens et algorithme de comparaison».]
4 Principes généraux applicables à la validation de méthodes d’identification
des micro-organismes
Le protocole de validation comprend deux étapes:
— une étude des caractéristiques de performance;
— une étude interlaboratoires.
NOTE 1 Pour les méthodes commerciales, l’étude de validation est effectuée par un laboratoire organisateur
(voir l’ISO 16140-1:2016, 2.45).
NOTE 2 Il est possible, le cas échéant, d’ajouter les données d’inclusivité ou d’exclusivité obtenues lors d’une étude
de validation selon l’ISO 16140-2 ou selon l’ISO 16140-6 à une étude en lien avec le présent document.
NOTE 3 En l’absence de méthode d’identification de référence, il n’existe pas d’étude de comparaison des méthodes.
Les règles techniques applicables à la réalisation de l’étude des caractéristiques de performance de la méthode
et de l’étude interlaboratoires sont données aux Articles 6 et 7. Un ensemble élargi de souches provenant
d’une gélose non sélective ou d’une gélose sélective s’il y a lieu (par exemple, levures et moisissures) sera
soumis à essai pour les deux parties.
Le cas échéant, le protocole de validation doit également spécifier le milieu sélectif à partir duquel les
souches peuvent être identifiées à l’aide de la méthode d’identification. Un nombre spécifié de souches doit
être soumis à essai.
NOTE 4 Le terme «gélose» est souvent utilisé pour désigner un «milieu de culture solide».
NOTE 5 L’application d’autres méthodes d’identification est possible (par exemple, identification de micro-
organismes dans un écosystème), voir l’Annexe A pour plus d’informations.
NOTE 6 Le mode opératoire d’identification peut être assuré par la collaboration de plusieurs laboratoires. Par
exemple, un premier laboratoire peut isoler les souches et effectuer la préparation de l’échantillon, comme l’extraction
et le séquençage de l’ADN; les données générées peuvent être analysées par comparaison avec la base de données
détenue et gérée par un second laboratoire. Dans ce cas, au cours de l’étude interlaboratoires, plusieurs collaborateurs
seront impliqués dans la préparation des échantillons et enverront les résultats pour analyse au laboratoire gérant
l’interprétation des données d’identification.
5 Souches
Les souches pures utilisées pour déterminer la fiabilité d’identification de la méthode doivent être
bien caractérisées conformément à l’objectif de l’étude de validation. Si nécessaire, les informations
d’identification fournies par une seconde identification servent à évaluer les divergences entre les résultats
du méthode d’identification soumis à essai et l’identité assignée de la souche.
NOTE 1 Des laboratoires de référence nationaux, régionaux ou internationaux peuvent être contactés pendant ces
recherches.
NOTE 2 Les souches correctement caractérisées sont des souches qui peuvent être obtenues à partir de collections
de culture nationales/internationales, ou des souches qui ont été obtenues localement et qui ont déjà été identifiées
et dont l’identité a été assignée en utilisant généralement au moins deux méthodes d’identification reposant sur des
principes différents.
NOTE 3 S’il y a lieu, sélectionner des souches disposant de données de WGS conformément à l’ISO 23418.
6 Caractéristiques de performance d’une méthode d’identification
6.1 Généralités
L’étude des caractéristiques de performance est la partie de la validation qui est effectuée dans un seul
laboratoire. Elle comprend une description du concept et de la ou des limites de la méthode d’identification,
ainsi qu’une étude de fiabilité d’identification de la méthode. Les résultats sont ensuite comparés à ceux des
identités assignées du groupe de souches soumises à essai.
6.2 Description du concept et de la ou des limites de la méthode d’identification
Les caractéristiques de la méthode décrites dans le Tableau 1 doivent être soigneusement décrites dans le
protocole de la méthode (par exemple, mode opératoire standard, instructions d’utilisation) pour permettre
une utilisation appropriée de la méthode d’identification par l’utilisateur final.
Tableau 1 — Principaux éléments de l’étude des caractéristiques de performance
Caractéristiques Informations détaillées
Domaine d’application de Description de la base de données, y compris nom, version et contenu
la validation
Milieu de culture
Nom ou type de micro-organisme (par exemple, bactérie, levure, moisissure,
bactérie lactique, Listeriaceae)
Version de l’algorithme de comparaison
Principe de la méthode Description du profil/de la séquence de la souche et de l’acquisition du signal de
d’identification l’instrument utilisée pour l’identification des micro-organismes
Contenu de la base de Liste des genres et des espèces dans la version de la base de données utilisée lors de
données l’étude de validation
Concept de la base de Description des types de profils de signal dans la base de données, par exemple un profil
données unique choisi pour représenter plusieurs souches de la même espèce ou plusieurs profils
de signal de différentes souches de la même espèce
Souches par espèce et Nombre de souches par espèce et par genre
par genre dans la base de
Au moins 5 souches sont requises pour revendiquer une espèce dans le contenu de la base
données
de données
TTabableleaauu 1 1 ((ssuuiitte)e)
Caractéristiques Informations détaillées
Limites Liste des espèces apparentées qui ne sont pas différenciées par la méthode d’identifica-
tion, taille de la base de données
Algorithme de Calcul des résultats rapportés, par exemple comparaison du profil de signal de
comparaison l’instrument de la souche analysée avec chaque profil dans la base de données, ou compa-
raison du profil de la souche analysée avec des profils moyens propres à chaque espèce de
la base de données.
Compte-rendu des Description du concept d’homologie utilisé pour déterminer les résultats d’identification
résultats avec un niveau de confiance élevé ou faible
Préparation des souches Description de la préparation des souches et du flux de travail de la méthode, en
et résolution des particulier en cas d’obtention de résultats d’homologie à faible niveau de confiance ou en
problèmes l’absence de résultat d’identification
Dans certains cas très spécifiques, le nombre minimal de souches par espèce dans la base de données peut
être inférieur aux 5 souches requises en raison d’un nombre insuffisant de souches disponibles. Il convient
que la base de données contienne une exclusion pour les souches qui ne satisfont pas à l’exigence minimale.
Si la méthode d’identification n’implique pas de base de données (par exemple, essai PCR multiplex),
il convient que la description du concept et de la ou des limites de la méthode d’identification se limite au
domaine d’application de la validation, au principe de la méthode d’identification, aux limites, au compte-
rendu des résultats, à la préparation des souches et à la résolution des problèmes.
6.3 Fiabilité d’identification de la méthode d’identification
6.3.1 Nombre de souches à soumettre à essai
Le jeu de souches à soumettre à essai dépend du contenu de la base de données et du domaine d’application
de la validation. Choisir, dans la mesure du possible, une souche par espèce pour s’assurer qu’au moins
25 % des genres et 10 % des espèces contenus dans la base de données sont soumis à essai. Toutefois, un
nombre minimal et un nombre maximal de souches à soumettre à essai ont été spécifiés, respectivement,
à 250 souches et 1 000 souches. En cas de contenu restreint de la base de données (par exemple, 25 genres
et 200 espèces), soumettre à essai tous les genres et espèces.
La Figure 4 fournit des exemples illustrant comment déterminer le nombre approprié de souches à soumettre
à essai.
Figure 4 — Exemples illustrant comment déterminer le nombre de souches à soumettre à essai
Toutes les souches sélectionnées doivent être soumises à essai par la méthode d’identification à partir de
cultures pures sur gélose non sélective.
NOTE 1 Les géloses non sélectives (par exemple, la TSA) permettent de récupérer une vaste gamme de micro-
organismes et peuvent favoriser la récupération de certains groupes spécifiés de micro-organismes. Pour les micro-
organismes pour lesquels les géloses non sélectives ne sont pas connues ou ne sont pas couvertes par des méthodes de
référence normalisées correspondantes pour l’isolement du micro-organisme respectif, seules les géloses sélectives
peuvent être utilisées à la place.
Si le domaine d’application de l’étude de validation comprend également des géloses sélectives, se référer au
Tableau 2 pour connaître le nombre de genres et d’espèces pertinentes qui doivent être soumis à essai pour
chaque gélose sélective incluse dans le domaine d’application.
NOTE 2 Les géloses sélectives peuvent permettre de récupérer les micro-organismes de clades spécifiques,
(i) famille, (ii) genre ou groupe d’espèces (par exemple, groupe Bacillus cereus). Dans le présent document,
«groupe d’espèces» est remplacé par «genre» pour une meilleure compréhension. Toutefois, le mot «genre» peut être
remplacé par «groupe d’espèces».
Tableau 2 — Nombre de souches à soumettre à essai pour chacune des géloses sélectives incluses
dans le domaine d’application
Rang taxonomique des souches récupérées Nombre de souches à soumettre à essai pour chacune des
sur les géloses sélectives soumises à essai géloses sélectives incluses dans le domaine d’application
Famille 100 souches, provenant du plus grand nombre possible de genres
et d’espèces différents, y compris des souches de plusieurs familles
qui peuvent se développer sur la gélose sélective
Genre 50 souches, provenant du plus grand nombre possible d’espèces
différentes, y compris des souches de plusieurs genres qui peuvent
se développer sur la gélose sélective
Espèce 25 souches qui peuvent se développer sur la gélose sélective
Sous-espèces, types 25 souches qui peuvent se développer sur la gélose sélective
Pour une méthode dont le domaine d’application est restreint (par exemple, essai PCR multiplex), il est
recommandé de soumettre à essai différents types de souches pertinentes dont il convient qu’elles ne
produisent pas de résultats d’identification (souches de témoin négatif) comme prévu par le domaine
d’application de la méthode (voir l’exemple à l’Article C.4).
6.3.2 Sélection des souches
Un large choix de souches doit être utilisé. Les critères utilisés pour la sélection des souches d’essai doivent
être conformes à l’Annexe B. Pour sélectionner les souches, il convient de prendre en compte le principe
de mesure (par exemple, essais phénotypiques ou moléculaires) et le contenu de la base de données de la
méthode d’identification. Des principes de mesure différents peuvent nécessiter l’utilisation de différents
types de souches d’essai, représentant la diversité des micro-organismes étudiés. Dans la mesure du
possible, il convient de ne pas utiliser les souches employées lors du développement de la base de données
dans la validation de la méthode d’identification, sauf si le nombre de souches disponibles est limité. Dans
ce cas, une description doit être incluse dans le rapport de l’étude de validation. La justification du choix
des souches et de leurs caractéristiques doit figurer dans le rapport d’étude de validation (par exemple,
couverture de la base de données, espèces apparentées, changements taxonomiques récents).
Choisir les souches parmi les espèces capables d’être récupérées sur la ou les géloses d’essai. Pour les géloses
sélectives, choisir les souches d’essai parmi plusieurs familles ou genres.
Chaque souche doit être caractérisée selon un degré de détail suffisant pour connaître son identité assignée
à l’aide d’essais phénotypiques ou moléculaires pertinents. La méthode ou le principe de la méthode utilisé
pour l’identification doit être connu.
Il convient en particulier que les souches aient été isolées à partir d’aliments, d’aliments pour animaux,
de l’environnement de transformation des aliments ou de production primaire selon le domaine d’application
de la validation. Toutefois, des souches cliniques peuvent également être utilisées. Il convient de connaître
la source d’origine de toutes les souches et que celles-ci soient conservées dans une collection de souches
locale (par exemple, d’un laboratoire expert), nationale ou internationale afin de pouvoir les utiliser lors
d’essais futurs si requis. Voir l’ISO 11133 pour des recommandations sur la conservation des cultures mères
dans les collections locales.
Les résultats obtenus par un laboratoire de référence spécialisé, à l’aide d’une méthode d’identification
appropriée, peuvent être utilisés si le laboratoire effectuant l’étude de validation n’est pas en mesure de
réaliser l’identification de souches rares.
6.3.3 Essais des souches
Les cultures p
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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