ISO 17601:2016

NORME ISO
INTERNATIONALE 17601
Première édition
2016-01-15
Qualité du sol — Estimation de
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
©
ISO 2016
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN . 4
5.2 Bactéries . 4
5.3 Plasmide . 4
5.4 Enzymes . 4
5.5 Produits chimiques . 4
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne . 5
5.7 Tampon et réactifs . 5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) . 6
7.1.1 Généralités . 6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) . 7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) . 7
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel . 7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3) .10
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2) .11
7.2.1 Généralités .11
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .11
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.2.4 Dilution de la matrice d’ADN .12
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) .13
7.3.1 Généralités .13
7.3.2 qPCR .13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) .13
7.4.1 Généralités .13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR .13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR .14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Étude interlaboratoires internationale .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l’évaluation de la
qPCR pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à
partir d’ADN extrait directement du sol .18
Bibliographie .31
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous–comité
SC 4, Méthodes biologiques.
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Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant
pour les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait
de différentes matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des
marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents
organismes (bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol et applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des
méthodes de microbiologie classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie
moléculaire reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une
alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition,
[2] [3] [4] [5] [6]
la richesse et la structure des communautés microbiennes.   Les approches reposant sur
l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité
microbienne. Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes
du sol reposent sur deux paramètres principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition
de la communauté microbienne indigène et b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des
amorces oligonucléotidiques, la concentration de l’ADN utilisé comme matrice, les erreurs de PCR ou
[7] [4] [8] [9]
encore la méthode d’analyse post-PCR choisie.
De nombreuses études ont été menées avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols. Récemment, l’ISO 11063
décrivant «une méthode pour extraire directement les acides nucléiques d’échantillons de sol», dérivée
de la Référence [10], a ouvert de nouvelles perspectives de développement d’approches moléculaires
[11]
normalisées pour estimer la qualité du sol.
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en
place et réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l’abondance de groupes microbiens du sol ainsi
que celle de groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens
du sol ainsi que des groupes fonctionnels par des essais de qPCR peut contribuer au développement
d’outils de routine permettant de surveiller la qualité du sol. La répétabilité et la reproductibilité de la
méthode d’amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative ont été évaluées
lors d’une étude interlaboratoires internationale (voir Annexe B). La répétabilité de cette méthode a été
évaluée avec succès pour les essais de qPCR ciblant les gènes ARNr 16S ainsi que des gènes codant un
marqueur fonctionnel de bactéries dénitrifiantes (le gène nitrite réductase nirK). La reproductibilité de
cette méthode a révélé un effet de laboratoire qui peut être surmonté en interprétant les résultats de la
quantification de l’abondance de groupes microbiens par comparais
...