ISO 21470:2020
(Main)Infant formula and adult nutritionals — Simultaneous determination of total vitamins B1, B2, B3 and B6 — Enzymatic digestion and LC-MS/MS
Infant formula and adult nutritionals — Simultaneous determination of total vitamins B1, B2, B3 and B6 — Enzymatic digestion and LC-MS/MS
This document specifies a method for the simultaneous quantitative determination of four water-soluble vitamins in infant formula and related nutritional products, including relevant forms of vitamins B1, B2, B3 and B6 by enzymatic digestion and UHPLC-MS/MS. This document is not intended to be used on products where vitamins have not been added.
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels pour adultes — Détermination simultanée de la teneur en vitamines B1, B2, B3 et B6 — Digestion enzymatique et CL-SM/SM
Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative simultanée de la teneur en quatre vitamines hydrosolubles dans les préparations pour nourrissons et les produits nutritionnels associés, notamment les formes pertinentes de vitamines B1, B2, B3 et B6 par digestion enzymatique et CLUHP-SM/SM. Le présent document n'est pas destiné à être utilisé pour des produits dans lesquels aucune vitamine n'a été ajoutée.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21470
First edition
2020-11
Infant formula and adult
nutritionals — Simultaneous
determination of total vitamins B , B ,
1 2
B and B — Enzymatic digestion and
3 6
LC-MS/MS
Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes —
Détermination simultanée de la teneur en vitamines B , B , B et B
1 2 3 6
— Digestion enzymatique et CL-SM/SM
Reference number
©
ISO 2020
© ISO 2020
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Published in Switzerland
ii © ISO 2020 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents and materials . 2
6 Standard and solution preparation . 3
6.1 Mobile phases and prepared solutions . 3
6.2 Stable isotope labelled compounds, individual, internal standard stock solutions . 4
6.3 Stock standard solutions of native compounds . 5
6.4 Working standard solution preparation . 6
6.5 Summary of standard and solution preparation . 7
7 Apparatus . 7
8 Procedure. 9
8.1 Sample preparation . 9
8.1.1 Powdered products . 9
8.1.2 Reconstituted powders and liquid products . 9
8.2 Enzymatic digestion . 9
8.3 UHPLC-MS/MS analysis . 9
8.3.1 UHPLC conditions . 9
8.3.2 MS tune conditions .10
8.3.3 Mass transitions .10
8.3.4 LC-MS/MS equilibration .11
8.4 Quality control .11
8.4.1 General.11
8.4.2 Calibration curve .11
9 Calculations.11
10 Precision data .13
10.1 General .13
10.2 Repeatability .13
10.3 Reproducibility .13
11 Test report .15
Annex A (informative) Precision data .16
Annex B (informative) Comparison between this document and EN 14122.25
Annex C (informative) Comparison between this document and EN 14152 .27
Annex D (informative) Comparison between this document and EN 14164 .29
Bibliography .31
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
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electrotechnical standardization.
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, in collaboration with
AOAC INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The
method described in this document is equivalent to the AOAC Official Method 2015.14: Simultaneous
Determination of Total Vitamins B , B , B , and B in Infant Formula and Related Nutritionals by Enzymatic
1 2 3 6
Digestion and LC-MS/MS.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21470:2020(E)
Infant formula and adult nutritionals — Simultaneous
determination of total vitamins B , B , B and B —
1 2 3 6
Enzymatic digestion and LC-MS/MS
1 Scope
This document specifies a method for the simultaneous quantitative determination of four water-
soluble vitamins in infant formula and related nutritional products, including relevant forms of vitamins
B , B , B and B by enzymatic digestion and UHPLC-MS/MS. This document is not intended to be used
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on products where vitamins have not been added.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www. iso. org/o bp
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
3.1
adult nutritional
nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the
sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,
starch and amino acids, with and without intact protein
3.2
infant formula
breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of
infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
4 Principle
Samples are prepared by enzymatic digestion with papain and α-amylase to hydrolyse protein and
complex carbohydrate and acid phosphatase to free phosphorylated vitamin forms. Stable-isotope
labelled internal standards are incorporated into the sample preparation to correct for variability in
both the sample preparation and instrument response. A series of six mixed working standard solutions
spanning two orders of magnitude in vitamin concentration are used to generate calibration curves
based on the peak response ratio of the analyte to its stable-isotope labelled internal standard.
Prepared samples and working standard solutions are injected onto ultra-high pressure liquid
chromatograph (UPLC) interfaced to a triple-quadrupole mass spectrometer (MS/MS) for analysis. The
MS/MS is configured to monitor precursor-fragment ion pairs for each analyte and internal standard.
This reaction forms the basis for method selectivity. Analytes are quantified by least squares regression
using the response ratio of the analyte to its internal standard.
5 Reagents and materials
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and
distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
5.1 Niacinamide (nicotinamide) (MW = 122,12), primary reference standard, e.g. USP Reference
1)
Standard, catalogue #1462006 . Follow the manufacturer’s storage and handling directions.
5.2 Niacin (nicotinic acid) (MW = 123,11), primary reference standard, e.g. USP Reference Standard,
1)
catalogue # 1461003 . Follow the manufacturer’s storage and handling directions.
5.3 Pyridoxine hydrochloride (MW = 205,64), primary reference standard, e.g. USP Reference
1)
Standard, catalogue # 1587001 . Follow the manufacturer’s storage and handling directions.
5.4 Riboflavin (MW = 376,36), primary reference standard, e.g. USP Reference Standard, catalogue #
1)
1603006 . Follow the manufacturer’s storage and handling directions.
5.5 Thiamine hydrochloride (MW = 337,27), primary reference standard, e.g. USP Reference Standard,
1)
catalogue #1656002 . Follow the manufacturer’s storage and handling directions. Measure the moisture
content of the powder prior to use or use the supplier certificate of analysis (COA) moisture value.
1)
5.6 Pyridoxamine dihydrochloride, Fluka Analytical Standard, catalogue #P9380 .
1)
5.7 Pyridoxal hydrochloride, Sigma, catalogue #P9130 .
2 1)
5.8 H -Niacinamide, CDN Isotopes, catalogue #D-3457 .
2 1)
5.9 H -Nicotinic acid, CDN Isotopes, catalogue #D-4368 .
13 13
5.10 C-Pyridoxine: pyridoxine:HCl (4,5-bis( hydroxymethyl)- C ), Cambridge Isotope
4 4
1)
Laboratory, catalogue #CLM-7563 .
2 1)
5.11 H -Pyridoxal, IsoSciences, catalogue #7098 .
2 1)
5.12 H -Pyridoxamine, IsoSciences, catalogue #7099 .
13 1)
5.13 C -Thiamine chloride, IsoSciences, catalogue #9209 .
13 15 1)
5.14 C , N-Riboflavin, IsoSciences, catalogue #7072 .
4 2
1)
5.15 Acid phosphatase, type II from potato, 0,5 U/mg to 3,0 U/mg, Sigma, catalogue #P3752 .
1)
5.16 Papain from Carica papaya, ≥ 3 U/mg, Sigma, catalogue #76220 .
1)
5.17 α–amylase from aspergillus oryzae, 150 U/mg, Sigma, catalogue #A9857 .
5.18 Hydrochloric acid concentrated (substance concentration c = 12 mol/l), ACS grade, or equivalent.
1)
5.19 Ammonium formate, for mass spectrometry (purity ≥ 99,0 %), Fluka 70221 or equivalent .
1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2020 – All rights reserved
1)
5.20 Glacial acetic acid, Sigma ACS reagent grade, or equivalent .
1)
5.21 Formic acid, Sigma ACS reagent grade, or equivalent .
5.22 Laboratory water, 18,0 MΩ, < 10 µg/kg TOC, or equivalent.
1)
5.23 Methanol, Fisher LC-MS/MS Optima grade or EMD Omni-Solve LC-MS grade .
5.24 Ethylenediaminetetracetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA), ACS grade (99 % to 101 %),
or equivalent.
5.25 Potassium phosphate dibasic, ACS grade (purity > 98 %), or equivalent.
5.26 meta-Phosphoric acid, ACS grade (33,5 % to 36,5 %), or equivalent.
5.27 Buffer solutions for pH meter calibration, pH = 4,0, 7,0 and 10,0.
5.28 Phosphoric acid, 85 g/100 g, ACS grade, or equivalent.
5.29 Potassium hydroxide, 40 g/100 g, ACS grade, or equivalent.
6 Standard and solution preparation
6.1 Mobile phases and prepared solutions
6.1.1 Mobile phase A, substance concentration c = 0,020 mol/l ammonium formate in water.
Using a graduated cylinder, transfer 500 ml laboratory water to a mobile phase reservoir. Add 0,631 g of
ammonium formate (5.19) and mix well. Expiration is three days.
6.1.2 Mobile phase B, methanol.
6.1.3 HCl solution, c = 0,12 mol/l.
Add approximately 300 ml of water to a 500 ml graduated cylinder. Add 5,0 ml ± 0,1 ml of concentrated
HCl solution (5.18) and swirl to mix. Bring to 500 ml with laboratory water and mix well.
6.1.4 Acetic acid solution, 1,0 ml/100 ml.
Add approximately 30 ml of water to a 500 ml graduated cylinder. Add 5,0 ml ± 0,1 ml of glacial acetic
acid (5.20) and swirl to mix. Bring to 500 ml with laboratory water and mix well.
6.1.5 Weak needle wash, 10 ml/100 ml methanol in water, expiration three months. Alternatively,
use week needle wash as recommended by the supplier.
6.1.6 Strong needle wash, methanol or as recommended by the supplier.
6.1.7 Ammonium formate solution, c = 0,050 mol/l.
Using a graduated cylinder, transfer 1 400 ml of laboratory water to an appropriate reservoir. Add
4,41 g of ammonium formate (5.19) and mix well. One 400 ml is adequate for 6 working standards and
32 samples. Scale as needed. Expiration is three days.
6.1.8 Mixed enzyme solution.
Using a graduated cylinder, transfer 200 ml of ammonium formate buffer (6.1.7) to an appropriate
reservoir. Add 200 mg ± 10 mg of acid phosphatase (5.15), 80 mg ± 5 mg of α-amylase (5.17) and
400 mg ± 10 mg of papain (5.16). Mix for 10 min with a magnetic stir plate and stir bar. Check pH and
adjust to 4,25 ± 0,25 with formic acid (5.21, approximately 100 μl). 200 ml is adequate for 6 working
standards and 32 samples. Scale as needed. Prepare fresh daily.
6.2 Stable isotope labelled compounds, individual, internal standard stock solutions
6.2.1 Internal standard stock solutions have an expiration of six months. However, the following
guidelines can be used to troubleshoot internal standards and, when documented as part of routine
system suitability checks, extend the expiration dates indefinitely.
Based on US FDA bioanalytical method validation guidelines, which state that the lowest-level
[9]
calibration shall be five times the analyte response of the blank, the channel of the non-labelled
analyte of interest shall be monitored to ensure the stable isotope-labelled internal standard does not
contribute more than 20 % of the area count of the lowest-level calibration standard. No response should
be generated in any other channels being monitored in the method, as this is a sign of contamination, in
which case fresh solution should be prepared or fresh lot of material should be ordered.
The area count of the internal standard should be at least three times the area count of the analyte in
the lowest-level calibration standard and the lowest level matrix-based QC sample.
6.2.2 H -Niacinamide stock solution, mass concentration ρ ≈ 560 µg/ml.
Weigh 14,0 mg ± 0,1 mg into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to a 25 ml volumetric
flask with laboratory water and fill to the mark with laboratory water. Mix well and transfer to a 50 ml
amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For expiration, see 6.2.1.
6.2.3 H -Nicotinic acid stock solution, ρ ≈ 500 µg/ml.
Weigh 12,5 mg ± 0,1 mg into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to a 25 ml volumetric
flask with laboratory water and fill to the mark with laboratory water. Mix well and transfer to a 50 ml
amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For expiration, see 6.2.1.
6.2.4 C -Pyridoxine stock solution, ρ ≈ 70 µg/ml.
Weigh 7,0 mg ± 0,1 mg into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to a 100 ml volumetric flask
with laboratory water and fill to the mark with laboratory water. Mix well and transfer to a 100 ml
amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For expiration, see 6.2.1.
6.2.5 H -Pyridoxal stock solution, ρ ≈ 40 µg/ml.
Weigh 4,0 mg ± 0,1 mg into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to a 100 ml volumetric flask
with laboratory water and fill to the mark with laboratory water. Mix well and transfer to a 100 ml
amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For expiration, see 6.2.1.
6.2.6 H -Pyridoxamine stock solution, ρ ≈ 40 µg/ml.
Weigh 4,0 mg ± 0,1 mg into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to a 100 ml volumetric flask
with laboratory water and fill to the mark with laboratory water. Mix well and transfer to a 100 ml
amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For expiration, see 6.2.1.
4 © ISO 2020 – All rights reserved
6.2.7 C -Thiamine chloride stock solution, ρ ≈ 100 µg/ml.
Weigh 5,0 mg ± 0,1 mg of C -thiamine into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to a 50 ml
volumetric flask with HCl solution (6.1.2) and fill to the mark with HCl solution (6.1.2). Mix well and
transfer to a 100 ml amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For expiration, see 6.2.1.
13 15
6.2.8 C , N-Riboflavin stock solution, ρ ≈ 73 µg/ml.
4 2
13 15
Weigh 7,3 mg ± 0,1 mg of C , N -riboflavin into a tared weighing vessel. Quantitatively transfer to
4 2
a 100 ml volumetric flask with acetic acid solution (6.1.3) and fill to the mark with acetic acid solution
(6.1.3). Mix well and transfer to a 100 ml amber bottle and store refrigerated (2 °C to 8 °C). For
expiration, see 6.2.1.
6.2.9 Internal standard stock mixture (ISSM).
Combine 2 500 μl of ammonium formate solution (6.1.7) with 250 μl of H -niacinamide stock solution
2 13
(6.2.2), 250 μl of H -nicotinic acid stock solution (6.2.3), 250 μl of C -pyridoxine stock solution (6.2.4),
4 4
2 2
200 μl of H -pyridoxal stock solution (6.2.5), 50 μl of H -pyridoxamine stock solution (6.2.6), 250 μl
3 3
13 13 15
of C -thiamine stock solution (6.2.7) and 250 μl of C , N -riboflavin stock solution (6.2.8). Volume
4 4 2
provides sufficient ISSM for 6 working standards and 32 samples. Scale as needed. Prepare fresh daily.
6.2.10 Phosphate buffer solution, pH = 5,0 (0,010 mol/l potassium phosphate dibasic, 1 g/100 g EDTA,
2 g/100 g metaphosphoric acid.
Weigh 20,0 g ± 0,2 g of EDTA into a tared weighing vessel and quantitatively transfer to a 2 000 ml
beaker containing approximately 1 800 ml laboratory water and add a magnetic stir bar.
Weigh 34,8 g ± 0,1 g of potassium phosphate dibasic into a tared weighing vessel and quantitatively
transfer to the 2 000 ml beaker already containing approximately 1 800 ml laboratory water and
EDTA. Mix by stirring on a magnetic stir plate until both the EDTA and potassium phosphate dibasic is
completely dissolved.
Weigh 40,0 g ± 0,2 g of metaphosphoric acid into a tared weighing vessel and quantitatively transfer
to the 2 000 ml beaker containing approximately 1 800 ml laboratory water, EDTA, and potassium
phosphate dibasic. Mix by stirring on a magnetic stir plate until the metaphosphoric acid is completely
dissolved.
Adjust the pH of the solution to pH = 5,00 ± 0,02 using 40 g/100 g potassium hydroxide or 85 g/100 g
phosphoric acid. Quantitatively transfer the solution to a 2 000 ml volumetric flask and dilute to volume
with laboratory water. Expiration: 48 hours.
6.3 Stock standard solutions of native compounds
6.3.1 Vitamin standard stock mixture (VSSM).
Accurately weigh the indicated amounts for the following standards using separate weighing funnels
or other appropriate weighing vessels and quantitatively transfer to a 100 ml volumetric flask using
phosphate buffer (pH = 5).
a) Niacinamide (5.1): 70,5 mg ± 0,5 mg.
b) Thiamine hydrochloride (5.5): 10,5 mg ± 0,2 mg.
Determine the moisture of the thiamine hydrochloride reference standard (5.5) as directed on
the container immediately prior to weighing or use moisture content from the supplier COA. The
per cent moisture determined for the reference standard is used to calculate the concentration of
thiamine in the VSSM.
c) Riboflavin (5.4): 7,0 mg ± 0,2 mg.
d) Pyridoxine hydrochloride (5.3): 10,8 mg ± 0,2 mg.
Fill to volume with phosphate buffer (pH = 5) solution. Heat and slowly stir until the standards have
completely dissolved (riboflavin dissolves more slowly) and the solution is clear. Do not heat the
solution for more than 40 min and do not exceed 90 °C. Store refrigerated (2 °C to 8 °C). Expiration:
three months.
6.3.2 Nicotinic acid stock solution, ρ = 550 mg/ml.
Accurately weigh 13,7 mg ± 0,1 mg niacin primary reference standard (5.2). Quantitatively transfer the
nicotinic acid to a 25 ml volumetric flask. Add laboratory water to a total volume of about 20 ml and swirl
until completely dissolved. Bring to volume with laboratory water. Mix well. Expiration: three months.
6.3.3 Pyridoxal stock solution, ρ = 140 mg/ml.
Accurately weigh 17,0 mg ± 0,5 mg pyridoxal dihydrochloride standard (5.7). Quantitatively transfer
to a 100 ml volumetric flask. Add laboratory water to a total volume of about 70 ml and swirl until
completely dissolved. Bring to volume with laboratory water. Mix well. Expiration: three months.
6.3.4 Pyridoxamine stock solution, ρ = 160 mg/ml.
Accurately weigh 23,0 mg ± 0,5 mg pyridoxamine hydrochloride standard (5.6). Quantitatively transfer
to a 100 ml volumetric flask. Add laboratory water to a total volume of about 70 ml and swirl until
completely dissolved. Bring to volume with laboratory water. Mix well. Expiration: three months.
6.3.5 Mixed working standard (MWS).
Combine 500 μl VSSM (6.3.1), 25 μl pyridoxamine stock (6.3.4), 25 μl pyridoxal stock (6.3.3), and 65 μl
nicotinic acid stock solutions (6.3.2) in a 10 ml volumetric flask containing approximately 5 ml of
ammonium formate solution (6.1.7). Bring to volume with ammonium formate solution (6.1.7) and mix
well. Prepare fresh daily.
6.4 Working standard solution preparation
6.4.1 Working solution (WS) 1.
Add 20 μl of MWS (6.3.5) and 980 μl of ammonium formate (6.1.7) to a 50 ml centrifuge tube. Add
100 μl of ISSM (6.2.9), and vortex to mix. Prepare fresh daily.
6.4.2 Working solution (WS) 2.
Add 50 μl of MWS (6.3.5) and 950 μl of ammonium formate (6.1.7) to a 50 ml centrifuge tube. Add
100 μl of ISSM (6.2.9), and vortex to mix. Prepare fresh daily.
6.4.3 Working solution (WS) 3.
Add 100 μl of MWS (6.3.5) and 900 μl of ammonium formate (6.1.7) to a 50 ml centrifuge tube. Add
100 μl of ISSM (6.2.9), and vortex to mix. Prepare fresh daily.
6.4.4 Working solution (WS) 4.
Add 200 μl of MWS (6.3.5) and 800 μl of ammonium formate (6.1.7) to a 50 ml centrifuge tube. Add
100 μl of ISSM (6.2.9), and vortex to mix. Prepare fresh daily.
6 © ISO 2020 – All rights reserved
6.4.5 Working solution (WS) 5.
Add 500 μl of MWS (6.3.5) and 500 μl of ammonium formate (6.1.7) to a 50 ml centrifuge tube. Add
100 μl of ISSM (6.2.9), and vortex to mix. Prepare fresh daily.
6.4.6 Working solution (WS) 6.
Add 1 000 μl of MWS (6.3.5). Add 100 μl of ISSM (6.2.9), and vortex to mix. Prepare fresh daily.
6.5 Summary of standard and solution preparation
See Table 1.
Table 1 — Summary of standard and solution preparation
Compound Mass Purity Mois- Volume Aliquot Volume Aliquot Aliquot Final
ture cor- stock stock of MWS of MWS of ISSM volume
rection solution (6.3.5) (6.2.9)
mg ml µl ml µl µl ml
Niacinamide
a
70,5 ± 0,5 0,999 1,000 100 500 10 see 6.4 100 30
(5.1)
Thiamine HCl
a b
10,5 ± 0,2 0997 0961 100 500 10 see 6.4 100 30
(5.5)
Riboflavin
a
7,0 ± 0,2 0,986 1,000 100 500 10 see 6.4 100 30
(5.4)
Pyridoxine
a
10,8 ± 0,2 0,999 1,000 100 500 10 see 6.4 100 30
(5.3)
a
Pyridoxal (5.7) 17,0 ± 0,5 0,990 1,000 100 25 10 see 6.4 100 30
Pyridoxamine
a
23,0 ± 0,5 0,980 1,000 100 25 10 see 6.4 100 30
(5.6)
Niacin
a
(nicotinic 13,7 ± 0,1 0,998 1,000 25 65 10 see 6.4 100 30
acid) (5.2)
a
Purity of the standard as defined by the manufacturer.
b
Moisture correction (1 – moisture content, from measurement or from the COA provided by the manufacturer).
7 Apparatus
2)
7.1 Waters® Acquity BEH C18 column or equivalent, 2,1 mm x 100 mm, 1,7 μm.
2)
7.2 UHPLC system, Waters Acquity Classic , or equivalent.
2)
7.3 Tandem quadrupole mass spectrometer with ESI probe, Waters Xevo TQ-S , or equivalent.
7.4 Analytical balances.
A balance capable of accurately weighing 5,00 mg (for standards), a six-place balance, an analytical
five-place balance for samples and a top-loading two-place balance capable of weighing to several
hundred grams.
2)
7.5 Water purifier, Millipore Milli-Q Water Purification System , or equivalent.
2) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
2)
7.6 Water bath shaker, capable of maintaining 37 °C, Lab-Line Orbit , or equivalent.
7.7 Bottle-top dispenser, capable of dispensing volumes of approximately 24 ml.
7.8 pH meter, capable of measuring pH = 4,0 to pH = 5,0.
7.9 Vortex mixer.
7.10 Multi-position magnetic stir plate.
2)
7.11 Room light shields, A.L.P. Protect-A-Lamp , UV cutoff at 460 nm, or equivalent. Alternatively, the
use of amber (brown) glassware and vials can be used.
7.12 Graduated cylinders, various sizes, including 10 ml, 100 ml, 500 ml and 1 000 ml.
7.13 Beakers, various sizes, including 100 ml, 200 ml, 400 ml, 600 ml, 1 000 ml and 2 000 ml.
7.14 Volumetric flasks, various sizes, including 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml and 2 000 ml.
7.15 Mobile phase bottles, glass, various sizes, including 250 ml, 500 ml, 1 000 ml and 2 000 ml.
7.16 Disposable plastic Pasteur pipettes.
7.17 Amber bottles, volume capacity of 50 ml and 100 m (for stock standard storage).
7.18 Weighing vessels, various, including disposable weighing boats and glass weighing funnels.
7.19 Positive displacement pipettes, 10 µl, 100 µl, 250 µl and 1 000 µl, Gilson Microman: Part
2)
#F148501, #F148504, #F148505 and #F148506 .
7.20 Positive displacement pipette tips, 10 µl, 100 µl, 250 µl and 1 000 µl, Gilson Capillary Piston:
2)
Part #F148312, #F148314, #F148014 and #F148560 .
7.21 Plastic syringes, 3 ml.
2)
7.22 Syringe filters, polytetrafluorethylene (PTFE) 0,45 µm syringe filters, Acrodisc 25 mm, or
equivalent.
2)
7.23 Plastic centrifuge tubes, 50 ml, self-standing, Superior Scientific, Ltd. , or equivalent.
7.24 Autosampler vials, Waters autosampler vials; 9 mm amber with screw top 12 mm x 32 mm pre-
2)
split PTFE-silicon septa; Waters Part # 186000847C, or equivalent .
7.25 PTFE coated magnetic stir bars.
8 © ISO 2020 – All rights reserved
8 Procedure
8.1 Sample preparation
8.1.1 Powdered products
Using a tared beaker or low-density polyethylene (LDPE) cup, accurately weigh 10,0 g ± 0,3 g of sample.
Record the mass to at least four significant figures. This is the powder mass. Add room temperature
laboratory water to bring the total reconstituted sample mass (to include the product mass) to
100 g ± 2 g. Record the mass to at least four significant figures. This is the reconstitution mass. Carefully
add a stir bar so as not to splash the liquid from the beaker/cup and place it onto a stir plate. Set the
stir plate to stir the sample as fast as possible without causing the sample to splatter or froth. Powder
samples should stir for at least 10 min but not more than 30 min.
8.1.2 Reconstituted powders and liquid products
Using a tared, 50 ml centrifuge tube, accurately weigh the appropriate sample amount (1,000 g ± 0,100 g
for infant formula, 0,500 g ± 0,050 g for paediatric formulas and the NIST SRM, and 0,250 g ± 0,050 g for
adult nutritionals). Record the mass to 0,000 1 g. This is the sample mass. Add 100 µl of the internal
standard stock mixture (6.2.9) via positive-displacement pipette. Vortex to mix.
8.2 Enzymatic digestion
Add 5 ml of mixed enzyme solution (6.1.8) to all prepared samples and working standards. Cap and
vortex immediately. Incubate at 37 °C overnight with agitation in water bath shaker. Remove from water
bath and add ammonium formate solution (6.1.7) to bring volume to approximately 30 ml and vortex to
mix. Filter approximately 2 ml aliquot of the sample extract into an appropriate size vial using a 0,45 µm
PTFE syringe filter. Transfer 60 μl of filtrate to an autosampler vial with 940 μl of ammonium formate
solution (6.1.7). Cap and vortex. The sample is ready for analysis. Samples have been determined to be
stable for at least 48 h at room temperature.
8.3 UHPLC-MS/MS analysis
8.3.1 UHPLC conditions
Place freshly prepared mobile phases, weak needle wash and strong needle wash onto the UHPLC
system. Purge old solvents from the solvent lines and needle washes. Injection volume is 10 μl and
column temperature is 40 °C. Mobile phase flow rate is 0,350 ml/min. Hold at 99 % mobile phase A
and 1,0 % mobile phase B for 0,50 min, then ramp to 8,0 % B over 2,00 min, ramp to 90 % B over the
next 2,50 min, and hold at 90 % B for 1,00 min. Return to 99 % mobile phase A and 1,0 % mobile phase
B over 0,10 min and hold for 1,9 min for re-equilibration. Total gradient program is 8,00 min long. See
Table 2 for a summary.
Table 2 — Summary of gradient programme
Time Mobile phase A Mobile phase B Flow rate
min % % ml/min
0,00 99 1 0,350
0,5 99 1 0,350
2,5 92 8 0,350
5,0 10 90 0,350
6,0 10 90 0,350
6,1 99 1 0,350
8,0 99 1 0,350
8.3.2 MS tune conditions
Clean the sample cone and MS source with 5 g/100 g aqueous formic acid prior to analysis. Tune
conditions can vary between instrument models and an appropriate balance shall be struck to achieve
an adequate signal for each compound. Determine the appropriate conditions experimentally for
3)
each instrument model. On a Waters TQ-S , ionization is performed by ESI+ at 2,5 kV. Additional tune
conditions include: source offset of 50 V, ion block temperature of 150 °C, desolvation gas temperature
of 500 °C, desolvation gas flow of 800 l/h, cone gas flow of 150 l/h, nebulizer gas pressure of 700 kPa
(7,00 bar), and collision gas flow of 0,15 ml/min with argon. Both quadrupoles are set to unit mass
resolution.
8.3.3 Mass transitions
Mass transitions for each vitamin and its corresponding internal standard are given in Table 3.
Retention time windows are also given in the table. Like the tune parameters, these parameters may
need adjusted based upon instrument model.
a
Table 3 — Conditions for MS transitions on a Waters TQ-S and retention time windows
Compound Function Start End Molecular Fragment Cone Collision Dwell
no. ion ion voltage energy time
min min V s
b
Niacinamide 1 2,71 3,20 122,9 80,1 20,0 16,0 0,025
Niacinamide 1 2,71 3,20 122,9 96,0 20,0 16,0 0,025
2 b
H -Niacinamide 1 2,71 3,20 127,0 84,0 20,0 16,0 0,025
H -Niacinamide 1 2,71 3,20 127,0 100,0 20,0 16,0 0,025
b
Nicotinic acid 2 0,50 1,70 124,0 80,0 20,0 16,0 0,025
Nicotinic acid 2 0,50 1,70 124,0 106,0 20,0 16,0 0,025
2 b
H -Nicotinic acid 2 0,50 1,70 128,0 84,1 20,0 16,0 0,025
H -Nicotinic acid 2 0,50 1,70 128,0 109,0 20,0 16,0 0,025
Pyridoxal 3 1,76 2,70 168,0 94,0 20,0 22,0 0,025
b
Pyridoxal 3 1,76 2,70 168,0 150,0 20,0 12,0 0,025
H -Pyridoxal 3 1,76 2,70 171,0 97,0 20,0 22,0 0,025
2 b
H -Pyridoxal 3 1,76 2,70 171,0 153,0 20,0 12,0 0,025
Pyridoxamine 4 0,50 1,70 169,0 134,0 20,0 20,0 0,025
b
Pyridoxamine 4 0,50 1,70 169,0 152,0 20,0 12,0 0,025
H -Pyridoxamine 4 0,50 1,70 172,0 136,0 20,0 20,0 0,025
2 b
H -Pyridoxamine 4 0,50 1,70 172,0 155,0 20,0 12,0 0,025
b
Pyridoxine 5 2,41 3,00 170,0 134,0 20,0 18,0 0,025
Pyridoxine 5 2,41 3,00 170,0 152,0 20,0 12,0 0,025
13 b
C -Pyridoxine 5 2,41 3,00 174,0 138,0 20,0 18,0 0,025
C -Pyridoxine 5 2,41 3,00 174,0 156,0 20,0 12,0 0,025
Thiamine 6 3,01 3,60 265,1 81,0 20,0 30,0 0,025
b
Thiamine 6 3,01 3,60 265,1 122,0 20,0 12,0 0,025
C -Thiamine 6 3,01 3,60 269,0 81,0 20,0 30,0 0,025
a
While the mass transitions are expected to remain the same across instrument platforms, the other parameters may
need to be adjusted to maximize sensitivity.
b
Indicates primary transition used in quantitation.
3) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
10 © ISO 2020 – All rights reserved
Table 3 (continued)
Compound Function Start End Molecular Fragment Cone Collision Dwell
no. ion ion voltage energy time
min min V s
13 b
C -Thiamine 6 3,01 3,60 269,0 122,0 20,0 12,0 0,025
Riboflavin 7 4,21 5,00 377,0 172,0 20,0 35,0 0,025
b
Riboflavin 7 4,21 5,00 377,0 243,0 20,0 20,0 0,025
13 15
C , N -Riboflavin 7 4,21 5,00 383,0 175,0 20,0 35,0 0,025
4 2
13 15 b
C , N -Riboflavin 7 4,21 5,00 383,0 249,0 20,0 20,0 0,025
4 2
a
While the mass transitions are expected to remain the same across instrument platforms, the other parameters may
need to be adjusted to maximize sensitivity.
b
Indicates primary transition used in quantitation.
8.3.4 LC-MS/MS equilibration
The instrument should be held at initial conditions (with mobile phase flow on and MS at temperature)
for 30 min to 60 min prior to injection. Alternatively, 6 to 10 blank injections at the start of a sequence
can be used for the same purpose.
8.4 Quality control
8.4.1 General
Bracket each calibration curve with blanks of ammonium formate solution (6.1.7) to enable a check for
laboratory background and instrumental carryover. Background should be no more than 5 % of the
signal for the lowest working standard.
8.4.2 Calibration curve
Calibration curves are set up to bracket the sample injections. Calibration residuals (relative error from
known concentration) are expected to be ≤ 20 % for pyridoxal and ≤ 8 % for the other vitamins. A
standard injection outside of this range can be excluded with evidence of a standard preparation error
in a single calibration level leading to a high or low response for all vitamins or evidence of a one-off
instrumental error, such as a missed injection.
9 Calculations
Calculate the mass concentration of vitamin stock solutions using Formula (1):
mM××SP××1000
s
ρ = (1)
stk
V
where
ρ is the vitamin standard stock solution mass concentration, in µg/ml;
stk
m is the mass of the standard, in mg;
s
M is the moisture content correction factor for the standard, if applicable;
S is the stoichiometric correction factor to convert the standard’s form, in Clause 5, to the form
that is reported (i.e. to report as thiamine ion [MW = 265,36] S = 265,36/337,27 = 0,7868);
P is the purity of the standard as defined by the manufacturer;
1 000 is the units conversion factor, from mg to µg;
V is the dissolution volume, in ml.
Calculate the vitamin mass concentrations in the mixed working standard (MWS, see 6.3.5) using
Formula (2):
V
SS
ρρ=× (2)
MWSstk
where
ρ is the vitamin mass concentration in the MWS, in ng/ml;
MWS
ρ is the vitamin mass concentration in the stock standard solution [see Formula (1)] in µg/ml;
stk
V is the volume of stock solution added to MWS, in µl;
SS
10 in ml.
Calculate the vitamin mass concentration in the working standard (WS, see 6.4.1 to 6.4.6) using
Formula (3):
V ×ρ
MWSMWS
ρ = (3)
WSi
where
ρ is the vitamin mass concentration in the working standard, in ng/ml;
WSi
V is the volume of the mixed working standard fortified in working standard, in µl;
MWS
ρ is the mass concentration of vitamin in the mixed working standard [MWS, see Formula (2)]
MWS
in ng/ml;
500 is the standard preparation dilution factor.
Calculate the vitamin mass fraction in the product, w , in µg/kg, using Formula (4):
pr
ρ ××m 500
as r
w = (4)
pr
mm×
sp
where
ρ is the vitamin mass concentration in the analytical sample as calculated from the calibration
as
curve, in ng/ml;
m is the total reconstitution mass, in g. For direct mass (liquid) samples, m = 1;
r r
500 is the dilution factor;
m is the analytical sample mass, in g;
s
m is the powder mass (for reconstituted samples), in g. For liquid samples, m = 1.
p p
For vitamin B and vitamin B , the reported concentration of the individual forms is summed to
3 6
report total. For example, concentration of niacinamide and nicotinic acid are summed to report “Total
12 © ISO 2020 – All rights reserved
vitamin B ” and concentration of pyridoxal, pyridoxamine, and pyridoxine are summed to report “Total
vitamin B ”.
10 Precision data
10.1 General
Details of the interlaboratory test of the precision of the method are summarized in Annex A. The values
derived from the interlaboratory test may not be applicable to analyte concentration ranges and/or
matrices other than those given in Annex A.
10.2 Repeatability
The absolute difference between two single test results found on identical test material by one operator
using the same apparatus within the shortest feasible time interval will exceed the repeatability limit r
in not more than 5 % of the cases. The values of r are given in Table 4.
10.3 Reproducibility
The absolute difference between two single test results found on identical test material reported by
two laboratories will exceed the reproducibility limit R in not more than 5 % of the cases. The values of
R are given in Table 4. The results of NIST SRM 1849a are in μg/100 g of powder. All other powders are
expressed as per 100 g of reconstituted powder (25 g powder plus 200 g water). Vitamin B is reported
as thiamine ion, vitamin B as riboflavin, vitamin B as niacin and vitamin B as pyridoxine.
2 3 6
Table 4 — Precision data
x
r R
Sample
μg/100 g
μg/100 g μg/100 g
Precision data for vitamin B
IF powder milk protein-based 122 6,87 23,6
IF powder soy-based 120 7,42 13,7
IF powder partially hydrolysed milk-based 82,5 4,80 28,3
IF powder partially hydrolysed soy-based 83,9 3,00 8,46
AN RTF high fat 185 8,19 98,7
AN RTF high protein 169 13,99 64,1
Child formula powder milk-based 48,8 3,14 9,97
IF powder stage 1 milk-based 112 6,32 20,8
IF RTF milk-based 34,0 3,44 13,1
IF RTF milk-based placebo 2,43 1,06 4,01
NIST SRM 1849a (results in μg/100 g powder) 1 307 126,4 176,6
Child formula powder milk-based 341 14,4 83,9
AN powder low fat 208 20,7 30,6
Infant elemental powder 176 12,0 14,7
IF powder FOS/GOS-based 65 3,03 11,0
Key
IF: infant formula
AN: adult nutritional
Table 4 (continued)
x r R
Sample
μg/100 g μg/100 g μg/100 g
Precision data for vitamin B
IF powder milk protein-based 204 23,0 41,9
IF powder soy-based 147 8,30 30,8
IF powder partially hydrolysed milk-based 175 11,8 23,7
IF powder partially hydrolysed so
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21470
Première édition
2020-11
Préparations pour nourrissons et
produits nutritionnels pour adultes —
Détermination simultanée de la
teneur en vitamines B , B , B et B —
1 2 3 6
Digestion enzymatique et CL-SM/SM
Infant formula and adult nutritionals — Simultaneous
determination of total vitamins B , B , B and B — Enzymatic
1 2 3 6
digestion and LC-MS/MS
Numéro de référence
©
ISO 2020
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CH-1214 Vernier, Genève
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Publié en Suisse
ii © ISO 2020 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs et matériaux . 2
6 Préparation des étalons et des solutions . 3
6.1 Phases mobiles et solutions préparées . 3
6.2 Composés marqués aux isotopes stables et solutions mères individuelles d’étalons
internes . 4
6.3 Solutions mères d’étalons de composés natifs . 6
6.4 Préparation de la solution d’étalons de travail . 7
6.5 Résumé de la préparation des étalons et des solutions . 8
7 Appareillage . 8
8 Mode opératoire. 9
8.1 Préparation de l’échantillon . 9
8.1.1 Produits en poudre . 9
8.1.2 Poudres reconstituées et produits liquides .10
8.2 Digestion enzymatique .10
8.3 Analyse CLHP-SM/SM .10
8.3.1 Conditions de CLUHP .10
8.3.2 Conditions de réglage du SM .11
8.3.3 Transitions des masses .11
8.3.4 Équilibrage du CL-SM/SM .12
8.4 Contrôle qualité .12
8.4.1 Généralités .12
8.4.2 Courbe d’étalonnage .12
9 Calculs .13
10 Données de fidélité .14
10.1 Généralités .14
10.2 Répétabilité .14
10.3 Reproductibilité .14
11 Rapport d’essai .17
Annexe A (informative) Données de fidélité .19
Annexe B (informative) Comparaison entre le présent document et l’EN 14122 .28
Annexe C (informative) Comparaison entre le présent document et l’EN 14152 .31
Annexe D (informative) Comparaison entre le présent document et l’EN 14164.33
Bibliographie .35
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, en
collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Il est publié par l’ISO, et séparément par l’AOAC
INTERNATIONAL. La méthode décrite dans le présent document est l’équivalent de la méthode officielle
de l’AOAC 2015.14: Simultaneous Determination of Total Vitamins B , B , B , and B in Infant Formula and
1 2 3 6
Related Nutritionals by Enzymatic Digestion and LC-MS/MS.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 21470:2020(F)
Préparations pour nourrissons et produits nutritionnels
pour adultes — Détermination simultanée de la teneur
en vitamines B , B , B et B — Digestion enzymatique et
1 2 3 6
CL-SM/SM
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative simultanée de la teneur en
quatre vitamines hydrosolubles dans les préparations pour nourrissons et les produits nutritionnels
associés, notamment les formes pertinentes de vitamines B , B , B et B par digestion enzymatique
1 2 3 6
et CLUHP-SM/SM. Le présent document n’est pas destiné à être utilisé pour des produits dans lesquels
aucune vitamine n’a été ajoutée.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
produit nutritionnel pour adultes
aliment spécialement formulé, complet sur le plan nutritionnel, consommé sous forme liquide, qui peut
constituer la seule source d’alimentation, constitué de n’importe quelle combinaison de lait, soja, riz,
lactosérum, protéine hydrolysée, amidon et acides aminés, avec et sans protéine intacte
3.2
préparation pour nourrissons
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire à lui seul les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de leur vie, jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
4 Principe
Des échantillons sont préparés par digestion enzymatique avec de la papaïne et de l’α-amylase pour
hydrolyser les protéines, les glucides complexes et la phosphatase acide en des formes de vitamines
phosphorylées libres. Des étalons internes marqués aux isotopes stables sont incorporés dans la
préparation des échantillons pour corriger la variabilité de préparation des échantillons et de réponse
de l’instrument. Une série de six solutions de travail du mélange d’étalons couvrant deux ordres de
grandeur en termes de concentration en vitamines est utilisée pour générer des courbes d'étalonnage
d’après le facteur de réponse maximale de l’analyte à son étalon interne marqué aux isotopes stables.
Les échantillons préparés et les solutions d’étalons de travail sont injectés dans un chromatographe
liquide à ultra-haute pression (CLUHP) couplé à un spectromètre de masse triple quadripôle (SM/SM)
en vue d’être analysés. Le SM/SM est configuré pour suivre pour chaque analyte et étalon interne des
paires d’ions précurseur-fragment. Cette réaction constitue la base de la sélectivité de la méthode. Les
analytes sont quantifiés à l’aide de la méthode des moindres carrés en utilisant le facteur de réponse de
l’analyte à son étalon interne.
5 Réactifs et matériaux
Pendant l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue, et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau d'une pureté équivalente.
5.1 Niacinamide (nicotinamide) (MM = 122,12), étalon de référence primaire, par exemple étalon
1)
de référence USP, référence 1462006 . Respecter les instructions de conservation et de manipulation
données par le fabricant.
5.2 Niacine (acide nicotinique) (MM = 123,11), étalon de référence primaire, par exemple étalon
1)
de référence USP, référence 1461003 . Respecter les instructions de conservation et de manipulation
données par le fabricant.
5.3 Chlorhydrate de pyridoxine (MM = 205,64), étalon de référence primaire, par exemple étalon
1)
de référence USP, référence 1587001 . Respecter les instructions de conservation et de manipulation
données par le fabricant.
5.4 Riboflavine (MM = 376,36), étalon de référence primaire, par exemple étalon de référence USP,
1)
référence 1603006 . Respecter les instructions de conservation et de manipulation données par le
fabricant.
5.5 Chlorhydrate de thiamine (MM = 337,27), étalon de référence primaire, par exemple étalon
1)
de référence USP, référence 1656002 . Respecter les instructions de conservation et de manipulation
données par le fabricant. Mesurer la teneur en humidité de la poudre avant emploi ou utiliser la valeur
d’humidité indiquée dans le certificat d’analyse du fournisseur.
1)
5.6 Dichlorhydrate de pyridoxamine, Fluka Analytical Standard, référence P9380 .
1)
5.7 Chlorhydrate de pyridoxal, Sigma, référence P9130 .
2 1)
5.8 H -niacinamide, CDN Isotopes, référence D-3457 .
2 1)
5.9 H -acide nicotinique, CDN Isotopes, référence D-4368 .
13 13
5.10 C -pyridoxine: pyridoxine: HCl (4,5-bis(hydroxyméthyl)- C ), Cambridge Isotope
4 4
1)
Laboratory, référence CLM-7563 .
2 1)
5.11 H -pyridoxal, IsoSciences, référence 7098 .
2 1)
5.12 H -pyridoxamine, IsoSciences, référence 7099 .
13 1)
5.13 C -chlorure de thiamine, IsoSciences, référence 9209 .
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils aboutissent aux mêmes
résultats.
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13 15 1)
5.14 C , N-riboflavine, IsoSciences, référence 7072 .
4 2
1)
5.15 Phosphatase acide, type II de pomme de terre, 0,5 U/mg à 3,0 U/mg, Sigma, référence P3752 .
1)
5.16 Papaïne de Carica papaya, ≥ 3 U/mg, Sigma, référence 76220 .
1)
5.17 α-amylase d’Aspergillus oryzae, 150 U/mg, Sigma, référence A9857 .
5.18 Acide chlorhydrique concentré (concentration c = 12 mol/l), qualité ACS, ou équivalent.
5.19 Formiate d’ammonium, pour la spectrométrie de masse (pureté ≥ 99,0 %), Fluka 70221 ou
1)
équivalent .
1)
5.20 Acide acétique glacial, Sigma, qualité réactif ACS, ou équivalent .
1)
5.21 Acide formique, Sigma, qualité réactif ACS, ou équivalent .
5.22 Eau de laboratoire, 18,0 MΩ, < 10 µg/kg COT, ou équivalente.
1)
5.23 Méthanol, Fisher, qualité LC-MS/MS Optima, ou EMD, qualité Omni-Solve LC-MS .
5.24 Acide éthylènediaminetétracétique, sel disodique dihydraté (EDTA), qualité ACS (99 % à
101 %), ou équivalent.
5.25 Phosphate de potassium dibasique, qualité ACS (pureté > 98 %), ou équivalent.
5.26 Acide métaphosphorique, qualité ACS (33,5 % à 36,5 %), ou équivalent.
5.27 Solutions tampons pour l’étalonnage du pH-mètre, pH = 4,0, 7,0 et 10,0.
5.28 Acide phosphorique, 85 g/100 g, qualité ACS, ou équivalent.
5.29 Hydroxyde de potassium, 40 g/100 g, qualité ACS, ou équivalent.
6 Préparation des étalons et des solutions
6.1 Phases mobiles et solutions préparées
6.1.1 Phase mobile A, concentration c = 0,020 mol/l de formiate d’ammonium dans l’eau.
À l’aide d’une éprouvette graduée, transférer 500 ml d’eau de laboratoire dans un réservoir de phase
mobile. Ajouter 0,631 g de formiate d’ammonium (5.19) et bien mélanger. La durée de conservation est
de trois jours.
6.1.2 Phase mobile B, méthanol.
6.1.3 Solution de HCl, c = 0,12 mol/l.
Ajouter environ 300 ml d’eau dans une éprouvette graduée de 500 ml. Ajouter 5,0 ml ± 0,1 ml de solution
de HCl concentrée (5.18) et remuer. Compléter à 500 ml avec de l’eau de laboratoire et bien mélanger.
6.1.4 Solution d’acide acétique, 1,0 ml/100 ml.
Ajouter environ 30 ml d’eau dans une éprouvette graduée de 500 ml. Ajouter 5,0 ml ± 0,1 ml d’acide
acétique glacial (5.20) et remuer. Compléter à 500 ml avec de l’eau de laboratoire et bien mélanger.
6.1.5 Liquide doux de rinçage de l’aiguille, 10 ml/100 ml de méthanol dans l’eau, d’une durée de
conservation de trois mois. Il est également possible d’utiliser le liquide doux de rinçage de l’aiguille
recommandé par le fournisseur.
6.1.6 Liquide fort de rinçage de l’aiguille, méthanol ou tel que recommandé par le fournisseur.
6.1.7 Solution de formiate d’ammonium, c = 0,050 mol/l.
À l’aide d’une éprouvette graduée, transférer 1 400 ml d’eau de laboratoire dans un réservoir approprié.
Ajouter 4,41 g de formiate d’ammonium (5.19) et bien mélanger. Un volume de 400 ml convient pour
6 solutions d’étalons de travail et 32 échantillons. Adapter si nécessaire. La durée de conservation est
de trois jours.
6.1.8 Solution du mélange d’enzymes
À l’aide d’une éprouvette graduée, transférer 200 ml de solution tampon formiate d’ammonium (6.1.7)
dans un réservoir approprié. Ajouter 200 mg ± 10 mg de phosphatase acide (5.15), 80 mg ± 5 mg
d’α-amylase (5.17) et 400 mg ± 10 mg de papaïne (5.16). Mélanger pendant 10 min avec une plaque
d’agitation magnétique et un barreau aimanté. Contrôler le pH et ajuster à 4,25 ± 0,25 avec de l’acide
formique (5.21, environ 100 μl). Un volume de 200 ml convient pour 6 solutions d’étalons de travail et
32 échantillons. Adapter si nécessaire. À préparer chaque jour.
6.2 Composés marqués aux isotopes stables et solutions mères individuelles d’étalons
internes
6.2.1 La durée de conservation des solutions mères d’étalons internes est de six mois. Toutefois, les
lignes directrices suivantes peuvent être utilisées pour résoudre les problèmes liés aux normes internes
et, lorsqu’elles sont documentées dans le cadre des contrôles de routine d’aptitude du système, pour
prolonger indéfiniment les dates limites d'utilisation.
Conformément aux lignes directrices de validation de la méthode bioanalytique de l’USFDA, qui
indiquent que le point le plus bas de la gamme d’étalonnage doit correspondre à cinq fois la réponse
[9]
de l’analyte du blanc , le canal de l’analyte d’intérêt non marqué doit être contrôlé pour s’assurer que
l'étalon interne marqué aux isotopes stables ne contribue pas à plus de 20 % de l’aire de l’étalon de
plus bas niveau. Il convient qu’aucune réponse ne soit générée dans les autres canaux surveillés dans
le cadre de la méthode. Dans le cas contraire, cela traduit une contamination, auquel cas il convient de
préparer une nouvelle solution ou de commander un nouveau lot de matériau.
Il convient que l’aire de l'étalon interne représente au moins trois fois l’aire de l’analyte de plus bas
niveau dans la gamme d’étalonnage et dans l'échantillon contrôle qualité de plus bas niveau.
6.2.2 Solution mère de H -niacinamide, concentration massique ρ ≈ 560 µg/ml.
Peser 14,0 mg ± 0,1 mg dans un récipient de pesée taré. Transférer quantitativement dans une fiole
jaugée de 25 ml contenant de l’eau de laboratoire et compléter jusqu’au trait avec de l’eau de laboratoire.
Bien mélanger et transférer dans un flacon ambré de 50 ml et conserver au réfrigérateur (entre 2 °C et
8 °C). Pour connaître la durée de conservation, voir 6.2.1.
6.2.3 Solution mère de H -acide nicotinique, ρ ≈ 500 µg/ml.
Peser 12,5 mg ± 0,1 mg dans un récipient de pesée taré. Transférer quantitativement dans une fiole
jaugée de 25 ml contenant de l’eau de laboratoire et compléter jusqu’au trait avec de l’eau de laboratoire.
4 © ISO 2020 – Tous droits réservés
Bien mélanger et transférer dans un flacon ambré de 50 ml et conserver au réfrigérateur (entre 2 °C et
8 °C). Pour connaître la durée de conservation, voir 6.2.1.
6.2.4 Solution mère de C -pyridoxine, ρ ≈ 70 µg/ml.
Peser 7,0 mg ± 0,1 mg dans un récipient de pesée taré. Transférer quantitativement dans une fiole jaugée
de 100 ml contenant de l’eau de laboratoire et compléter jusqu’au trait avec de l’eau de laboratoire. Bien
mélanger et transférer dans un flacon ambré de 100 ml et conserver au réfrigérateur (entre 2 °C et
8 °C). Pour connaître la durée de conservation, voir 6.2.1.
6.2.5 Solution mère de H -pyridoxal, ρ ≈ 40 µg/ml.
Peser 4,0 mg ± 0,1 mg dans un récipient de pesée taré. Transférer quantitativement dans une fiole jaugée
de 100 ml contenant de l’eau de laboratoire et compléter jusqu’au trait avec de l’eau de laboratoire. Bien
mélanger et transférer dans un flacon ambré de 100 ml et conserver au réfrigérateur (entre 2 °C et
8 °C). Pour connaître la durée de conservation, voir 6.2.1.
6.2.6 Solution mère de H -pyridoxamine, ρ ≈ 40 µg/ml.
Peser 4,0 mg ± 0,1 mg dans un récipient de pesée taré. Transférer quantitativement dans une fiole jaugée
de 100 ml contenant de l’eau de laboratoire et compléter jusqu’au trait avec de l’eau de laboratoire. Bien
mélanger et transférer dans un flacon ambré de 100 ml et conserver au réfrigérateur (entre 2 °C et
8 °C). Pour connaître la durée de conservation, voir 6.2.1.
6.2.7 Solution mère de C -chlorure de thiamine, ρ ≈ 100 µg/ml.
Peser 5,0 mg ± 0,1 mg de C -thiamine dans un récipient de pesée taré. Transférer quantitativement
dans une fiole jaugée de 50 ml contenant une solution de HCl (6.1.2) et compléter jusqu’au trait avec la
solution de HCl (6.1.2). Bien mélanger et transférer dans un flacon ambré de 100 ml et conserver au
réfrigérateur (entre 2 °C et 8 °C). Pour connaître la durée de conservation, voir 6.2.1.
13 15
6.2.8 Solution mère de C , N-riboflavine, ρ ≈ 73 µg/ml.
4 2
13 15
Peser 7,3 mg ± 0,1 mg de C , N -riboflavine dans un récipient de pesée taré. Transférer
4 2
quantitativement dans une fiole jaugée de 100 ml contenant une solution d’acide acétique (6.1.3) et
compléter jusqu’au trait avec la solution d’acide acétique (6.1.3). Bien mélanger et transférer dans un
flacon ambré de 100 ml et conserver au réfrigérateur (entre 2 °C et 8 °C). Pour connaître la durée de
conservation, voir 6.2.1.
6.2.9 Solution mère d’étalons internes (ISSM)
Mélanger 2 500 μl de solution de formiate d’ammonium (6.1.7) avec 250 μl de solution mère de H -
niacinamide (6.2.2), 250 μl de solution mère de H -acide nicotinique (6.2.3), 250 μl de solution mère de
13 2 2
C -pyridoxine (6.2.4), 200 μl de solution mère de H -pyridoxal (6.2.5), 50 μl de solution mère de H -
4 3 3
pyridoxamine (6.2.6), 250 μl de solution mère de C -thiamine (6.2.7) et 250 μl de solution mère de
13 15
C , N -riboflavine (6.2.8). Un volume suffisant d’ISSM convient pour 6 solutions d’étalons de travail
4 2
et 32 échantillons. Adapter si nécessaire. À préparer chaque jour.
6.2.10 Solution tampon phosphate, pH = 5,0 (0,010 mol/l de phosphate de potassium dibasique,
1 g/100 g d’EDTA, 2 g/100 g d’acide métaphosphorique).
Peser 20,0 g ± 0,2 g d’EDTA dans un récipient de pesée taré, transférer quantitativement dans un bécher
de 2 000 ml contenant environ 1 800 ml d’eau de laboratoire et ajouter un barreau aimanté.
Peser 34,8 g ± 0,1 g de phosphate de potassium dibasique dans un récipient de pesée taré et transférer
quantitativement dans le bécher de 2 000 ml contenant déjà environ 1 800 ml d’eau de laboratoire
et d’EDTA. Mélanger en agitant sur une plaque d'agitation magnétique jusqu’à ce que l’EDTA et le
phosphate de potassium dibasique soient complètement dissous.
Peser 40,0 g ± 0,2 g d’acide métaphosphorique dans un récipient de pesée taré et transférer
quantitativement dans le bécher de 2 000 ml contenant environ 1 800 ml d’eau de laboratoire, d’EDTA
et de phosphate de potassium dibasique. Mélanger en agitant sur une plaque d'agitation magnétique
jusqu’à ce que l’acide métaphosphorique soit complètement dissous.
Ajuster le pH de la solution à pH = 5,00 ± 0,02 en utilisant 40 g/100 g d’hydroxyde de potassium ou
85 g/100 g d’acide phosphorique. Transférer quantitativement la solution dans une fiole jaugée de
2 000 ml et diluer au volume avec de l’eau de laboratoire. Durée de conservation: 48 h.
6.3 Solutions mères d’étalons de composés natifs
6.3.1 Solution mère d’étalons de vitamines (VSSM)
Peser exactement les quantités indiquées pour les étalons suivants en utilisant des entonnoirs de pesée
séparés ou d’autres récipients de pesée appropriés et transférer quantitativement dans une fiole jaugée
de 100 ml en utilisant le tampon phosphate (pH = 5).
a) Niacinamide (5.1): 70,5 mg ± 0,5 mg.
b) Chlorhydrate de thiamine (5.5): 10,5 mg ± 0,2 mg.
Déterminer la teneur en humidité de l’étalon de référence chlorhydrate de thiamine (5.5) comme
indiqué sur le conditionnement juste avant de peser, ou utiliser la teneur en humidité notée dans le
certificat d’analyse du fournisseur. Le pourcentage d’humidité déterminé pour l’étalon de référence
sert à calculer la concentration en thiamine de la VSSM.
c) Riboflavine (5.4): 7,0 mg ± 0,2 mg.
d) Chlorhydrate de pyridoxine (5.3): 10,8 mg ± 0,2 mg.
Compléter au volume avec la solution tampon phosphate (pH = 5). Chauffer et agiter lentement jusqu’à ce
que les étalons soient complètement dissous (la riboflavine se dissout plus lentement) et que la solution
soit claire. Ne pas chauffer la solution pendant plus de 40 min et ne pas dépasser 90 °C. Conserver au
réfrigérateur (entre 2 °C et 8 °C). Durée de conservation: trois mois.
6.3.2 Solution mère d’acide nicotinique, ρ = 550 mg/ml.
Peser exactement 13,7 mg ± 0,1 mg d'étalon primaire de référence niacine (5.2). Transférer
quantitativement l’acide nicotinique dans une fiole jaugée de 25 ml. Ajouter de l’eau de laboratoire
jusqu’à atteindre un volume total d’environ 20 ml et remuer jusqu’à dissolution complète. Compléter au
volume avec de l’eau de laboratoire. Bien mélanger. Durée de conservation: trois mois.
6.3.3 Solution mère de pyridoxal, ρ = 140 mg/ml.
Peser exactement 17,0 mg ± 0,5 mg d'étalon dichlorhydrate de pyridoxal (5.7). Transférer
quantitativement dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter de l’eau de laboratoire jusqu’à atteindre un
volume total d’environ 70 ml et remuer jusqu’à dissolution complète. Compléter au volume avec de l’eau
de laboratoire. Bien mélanger. Durée de conservation: trois mois.
6.3.4 Solution mère de pyridoxamine, ρ = 160 mg/ml.
Peser exactement 23,0 mg ± 0,5 mg d'étalon chlorhydrate de pyridoxamine (5.6). Transférer
quantitativement dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter de l’eau de laboratoire jusqu’à atteindre un
volume total d’environ 70 ml et remuer jusqu’à dissolution complète. Compléter au volume avec de l’eau
de laboratoire. Bien mélanger. Durée de conservation: trois mois.
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6.3.5 Solution de travail du mélange d’étalons (MWS)
Mélanger 500 μl de VSSM (6.3.1), 25 μl de solution mère de pyridoxamine (6.3.4), 25 μl de solution
mère de pyridoxal (6.3.3) et 65 μl de solution mère d’acide nicotinique (6.3.2) dans une fiole jaugée de
10 ml contenant environ 5 ml de solution de formiate d’ammonium (6.1.7). Compléter au volume avec la
solution de formiate d’ammonium (6.1.7) et bien mélanger. À préparer chaque jour.
6.4 Préparation de la solution d’étalons de travail
6.4.1 Solution de travail (WS) 1
Ajouter 20 μl de MWS (6.3.5) et 980 μl de formiate d’ammonium (6.1.7) dans un tube à centrifuger de
50 ml. Ajouter 100 μl d’ISSM (6.2.9) et mélanger au vortex. À préparer chaque jour.
6.4.2 Solution de travail (WS) 2
Ajouter 50 μl de MWS (6.3.5) et 950 μl de formiate d’ammonium (6.1.7) dans un tube à centrifuger de
50 ml. Ajouter 100 μl d’ISSM (6.2.9) et mélanger au vortex. À préparer chaque jour.
6.4.3 Solution de travail (WS) 3
Ajouter 100 μl de MWS (6.3.5) et 900 μl de formiate d’ammonium (6.1.7) dans un tube à centrifuger de
50 ml. Ajouter 100 μl d’ISSM (6.2.9) et mélanger au vortex. À préparer chaque jour.
6.4.4 Solution de travail (WS) 4
Ajouter 200 μl de MWS (6.3.5) et 800 μl de formiate d’ammonium (6.1.7) dans un tube à centrifuger de
50 ml. Ajouter 100 μl d’ISSM (6.2.9) et mélanger au vortex. À préparer chaque jour.
6.4.5 Solution de travail (WS) 5
Ajouter 500 μl de MWS (6.3.5) et 500 μl de formiate d’ammonium (6.1.7) dans un tube à centrifuger de
50 ml. Ajouter 100 μl d’ISSM (6.2.9) et mélanger au vortex. À préparer chaque jour.
6.4.6 Solution de travail (WS) 6
Ajouter 1 000 μl de MWS (6.3.5). Ajouter 100 μl d’ISSM (6.2.9) et mélanger au vortex. À préparer
chaque jour.
6.5 Résumé de la préparation des étalons et des solutions
Voir le Tableau 1.
Tableau 1 — Résumé de la préparation des étalons et des solutions
Composé Masse Pureté Correc- Volume Ali- Volume Aliquote Aliquote Volume
tion de de quote de de MWS de MWS d’ISSM final
l’humidité solution solution (6.3.5) (6.2.9)
mère mère
mg ml µl ml µl µl ml
Niacinamide
a
70,5 ± 0,5 0,999 1,000 100 500 10 voir 6.4 100 30
(5.1)
Chlorhydrate
a b
de thiamine 10,5 ± 0,2 0,997 0,961 100 500 10 voir 6.4 100 30
(5.5)
Riboflavine
a
7,0 ± 0,2 0,986 1,000 100 500 10 voir 6.4 100 30
(5.4)
Pyridoxine
a
10,8 ± 0,2 0,999 1,000 100 500 10 voir 6.4 100 30
(5.3)
a
Pyridoxal (5.7) 17,0 ± 0,5 0,990 1,000 100 25 10 voir 6.4 100 30
Pyridoxamine
a
23,0 ± 0,5 0,980 1,000 100 25 10 voir 6.4 100 30
(5.6)
Niacine (acide
a
nicotinique) 13,7 ± 0,1 0,998 1,000 25 65 10 voir 6.4 100 30
(5.2)
a
Pureté de l’étalon telle que définie par le fabricant.
b
Correction de l’humidité (1 – teneur en humidité, après mesurage ou d’après le certificat d’analyse fourni par le
fabricant).
7 Appareillage
2)
7.1 Colonne Waters® Acquity BEH C18 ou équivalente, 2,1 mm x 100 mm, 1,7 μm.
2)
7.2 Système CLUHP, Waters Acquity Classic , ou équivalent.
2)
7.3 Spectromètre de masse en tandem quadripôle avec sonde ESI, Waters Xevo TQ-S , ou
équivalent.
7.4 Balances analytiques.
Balance capable de peser exactement 5,00 mg (pour les étalons), balance à six décimales, balance
analytique à cinq décimales pour les échantillons et balance à deux décimales, avec chargement par le
haut, capable de peser jusqu’à plusieurs centaines de grammes.
2)
7.5 Purificateur d’eau, système de purification d’eau Millipore Milli-Q , ou équivalent.
2)
7.6 Agitateur bain-marie, capable de maintenir une température de 37 °C, Lab-Line Orbit , ou
équivalent.
2) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils aboutissent aux mêmes
résultats.
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7.7 Dispensette adaptable sur flacon, capable de distribuer des volumes d’environ 24 ml.
7.8 pH-mètre, capable de mesurer un pH = 4,0 à pH = 5,0.
7.9 Mélangeur vortex.
7.10 Plaque d’agitation magnétique multi-positions.
2)
7.11 Pare-lumière, A.L.P. Protect-A-Lamp , seuil de coupure UV à 460 nm, ou équivalent. Il est
également possible d’utiliser une verrerie et des flacons ambrés (bruns).
7.12 Éprouvettes graduées, différentes tailles, notamment 10 ml, 100 ml, 500 ml et 1 000 ml.
7.13 Béchers, différentes tailles, notamment 100 ml, 200 ml, 400 ml, 600 ml, 1 000 ml et 2 000 ml.
7.14 Fioles jaugées, différentes tailles, notamment 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml et 2 000 ml.
7.15 Flacons de phase mobile, différentes tailles, notamment 250 ml, 500 ml, 1 000 ml et 2 000 ml.
7.16 Pipettes Pasteur à usage unique en plastique.
7.17 Flacons ambrés, volumes de 50 ml et 100 ml (pour conserver la solution mère d’étalons).
7.18 Récipients de pesée, différentes tailles, notamment coupelles de pesée à usage unique et
entonnoirs de pesée en verre.
7.19 Pipettes volumétriques, 10 µl, 100 µl, 250 µl et 1 000 µl, Gilson Microman: références F148501,
2)
F148504, F148505 et F148506 .
7.20 Pointes de pipettes volumétriques, 10 µl, 100 µl, 250 µl et 1 000 µl, Gilson Capillary Piston:
2)
références F148312, F148314, F148014 et F148560 .
7.21 Seringues en plastique, 3 ml.
2)
7.22 Filtres seringues, polytétrafluoroéthylène (PTFE) 0,45 µm, Acrodisc 25 mm, ou équivalents.
2)
7.23 Tubes à centrifuger en plastique, 50 ml, autoporteurs, Superior Scientific, Ltd , ou équivalents.
7.24 Flacons pour échantillonneur automatique, Waters; flacons ambrés de 9 mm avec bouchon
à vis et septum pré-percé en silicone/PTFE de 12 mm x 32 mm; référence Waters 186000847C, ou
2)
équivalents .
7.25 Barreaux aimantés revêtus de PTFE.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation de l’échantillon
8.1.1 Produits en poudre
À l’aide d’un bécher taré ou d’une coupelle en polyéthylène basse densité (LDPE), peser exactement
10,0 g ± 0,3 g d’échantillon. Enregistrer la masse à au moins quatre chiffres significatifs. Il s’agit de la
masse de poudre. Ajouter de l’eau de laboratoire à température ambiante de façon à porter la masse
totale d’échantillon reconstitué (incluant la masse du produit) à 100 g ± 2 g. Enregistrer la masse à
au moins quatre chiffres significatifs. Il s’agit de la masse de reconstitution. Ajouter délicatement un
barreau aimanté pour ne pas éclabousser le liquide du bécher/de la coupelle et le placer sur une plaque
d’agitation. Régler la plaque d’agitation de façon qu’elle agite l’échantillon le plus vite possible sans
éclaboussure ou formation de mousse. Il convient d’agiter les échantillons en poudre pendant au moins
10 min mais pas plus de 30 min.
8.1.2 Poudres reconstituées et produits liquides
À l’aide d’un tube à centrifuger taré de 50 ml, peser exactement la quantité d'échantillon appropriée
(1,000 g ± 0,100 g pour les préparations pour nourrissons, 0,500 g ± 0,050 g pour les préparations
pour enfants en bas âge et les matériaux de référence du NIST, et 0,250 g ± 0,050 g pour les produits
nutritionnels pour adultes). Enregistrer la masse à 0,000 1 g. Il s’agit de la masse de l'échantillon. À
l’aide de la pipette volumétrique, ajouter 100 µl de la solution mère d’étalons internes (6.2.9). Mélanger
au vortex.
8.2 Digestion enzymatique
Ajouter 5 ml de solution du mélange d’enzymes (6.1.8) à tous les échantillons préparés et solutions
d’étalons de travail. Fermer et mélanger immédiatement au vortex. Incuber toute une nuit à 37 °C
en agitant dans un agitateur bain-marie. Sortir du bain-marie et ajouter la solution de formiate
d’ammonium (6.1.7) pour porter le volume à environ 30 ml et mélanger au vortex. À l’aide d'un filtre
seringue en PTFE de 0,45 µm, filtrer une aliquote d’environ 2 ml de l’échantillon dans un flacon de taille
appropriée. Transférer 60 μl de filtrat dans un flacon pour échantillonneur automatique avec 940 μl de
solution de formiate d’ammonium (6.1.7). Fermer et mélanger au vortex. L’échantillon est prêt à être
analysé. Les échantillons sont stables pendant au moins 48 heures à température ambiante.
8.3 Analyse CLHP-SM/SM
8.3.1 Conditions de CLUHP
Placer les phases mobiles fraîchement préparées, le liquide doux de rinçage de l’aiguille et le liquide fort
de rinçage de l’aiguille sur le système de CLUHP. Purger les anciens solvants des conduites de solvant
et les anciens liquides de rinçage des aiguilles. Le volume d’injection est de 10 μl et la température de
la colonne est de 40 °C. Le débit de la phase mobile est de 0,350 ml/min. Maintenir à 99 % de phase
mobile A et 1,0 % de phase mobile B pendant 0,50 min, puis augmenter par palier de 8,0 % de phase
mobile B pendant 2,00 min, augmenter jusqu’à 90 % de phase mobile B pendant les 2,50 min suivantes,
et maintenir à 90 % de phase mobile B pendant 1,00 min. Revenir à 99 % de phase mobile A et 1,0 % de
phase mobile B pendant 0,10 min et maintenir pendant 1,9 min pour le rééquilibrage. La durée totale du
programme de gradient est de 8,00 min. Voir le Tableau 2 pour avoir un résumé.
Tableau 2 — Résumé du programme de gradient
Temps Phase mobile A Phase mobile B Débit
min % % ml/min
0,00 99 1 0,350
0,5 99 1 0,350
2,5 92 8 0,350
5,0 10 90 0,350
6,0 10 90 0,350
6,1 99 1 0,350
8,0 99 1 0,350
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8.3.2 Conditions de réglage du SM
Nettoyer le cône d’échantillonnage et la source SM avec 5 g/100 g d’acide formique aqueux avant analyse.
Les conditions de réglage peuvent varier selon les modèles d'instrument et un équilibre approprié
doit être atteint pour obtenir un signal adéquat pour chaque composé. Déterminer les conditions
3)
appropriées expérimentalement pour chaque modèle d'instrument. Sur un Waters TQ-S , l’ionisation
est effectuée par ESI+ à 2,5 kV. Conditions de réglage supplémentaires: décalage (offset) de la source
de 50 V, température du bloc d'ions de 150 °C, température du gaz de désolvatation de 500 °C, débit
du gaz de désolvatation de 800 l/h, débit du gaz de cône de 150 l/h, pression du gaz de nébulisation de
700 kPa (7,00 bar) et débit du gaz de collision de 0,15 ml/min avec l’argon. Les deux quadripôles ont une
résolution de masse unitaire.
8.3.3 Transitions des masses
Les transitions des masses pour chaque vitamine et son étalon interne correspondant sont données
dans le Tableau 3. Les fenêtres de temps de rétention sont également indiquées dans le tableau. Tout
comme les paramètres de réglage, il peut être nécessaire d’ajuster ces paramètres en fonction du
modèle d'instrument.
a
Tableau 3 — Conditions des transitions SM sur un Waters TQ-S et fenêtres de temps de
rétention
Composé Fonction Début Fin Ion parent Ion fils Tension Énergie Temps
n° du cône de de séjour
collision (dwell
time)
min min V s
b
Niacinamide 1 2,71 3,20 122,9 80,1 20,0 16,0 0,025
Niacinamide 1 2,71 3,20 122,9 96,0 20,0 16,0 0,025
2 b
H -niacinamide 1 2,71 3,20 127,0 84,0 20,0 16,0 0,025
H -niacinamide 1 2,71 3,20 127,0 100,0 20,0 16,0 0,025
b
Acide nicotinique 2 0,50 1,70 124,0 80,0 20,0 16,0 0,025
Acide nicotinique 2 0,50 1,70 124,0 106,0 20,0 16,0 0,025
H -acide nicotini- 2 0,50 1,70 128,0 84,1 20,0 16,0 0,025
b
que
H -acide nicotini- 2 0,50 1,70 128,0 109,0 20,0 16,0 0,025
b
que
Pyridoxal 3 1,76 2,70 168,0 94,0 20,0 22,0 0,025
b
Pyridoxal 3 1,76 2,70 168,0 150,0 20,0 12,0 0,025
H -pyridoxal 3 1,76 2,70 171,0 97,0 20,0 22,0 0,025
2 b
H -pyridoxal 3 1,76 2,70 171,0 153,0 20,0 12,0 0,025
Pyridoxamine 4 0,50 1,70 169,0 134,0 20,0 20,0 0,025
b
Pyridoxamine 4 0,50 1,70 169,0 152,0 20,0 12,0 0,025
H -pyridoxamine 4 0,50 1,70 172,0 136,0 20,0 20,0 0,025
2 b
H -pyridoxamine 4 0,50 1,70 172,0 155,0 20,0 12,0 0,025
b
Pyridoxine 5 2,41 3,00 170,0 134,0 20,0 18,0 0 025
a
Alors que les transitions des masses sont censées rester les mêmes d’une plate-forme d’instrument à l’autre, il peut être
nécessaire d’ajuster les autres paramètres pour maximiser la sensibilité.
b
Indique la transition primaire utilisée lors de la quantification.
3) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils aboutissent aux mêmes
résultats.
Tableau 3 (suite)
Composé Fonction Début Fin Ion parent Ion fils Tension Énergie Temps
n° du cône de de séjour
collision (dwell
time)
min min V s
Pyridoxine 5 2,41 3,00 170,0 152,0 20,0 12,0 0,025
13 b
C -pyridoxine 5 2,41 3,00 174,0 138,0 20,0 18,0 0,025
C -pyridoxine 5 2,41 3,00 174,0 156,0 20,0 12,0 0,025
Thiamine 6 3,01 3,60 265,1 81,0 20,0 30,0 0 025
b
Thiamine 6 3,01 3,60 265,1 122,0 20,0 12,0 0,025
C -thiamine 6 3,01 3,60 269,0 81,0 20,0 30,0 0,025
13 b
C -thiamine 6 3,01 3,60 269,0 122,0 20,0 12,0 0,025
Riboflavine 7 4,21 5,00 377,0 172,0 20,0 35,0 0,025
b
Riboflavine 7 4,21 5,00 377,0 243,0 20,0 20,0 0,025
13 15
C , N -ribofla- 7 4,21 5,00 383,0 175,0 20,0 35,0 0,025
4 2
vine
13 15
C , N -ribofla- 7 4,21 5,00 383,0 249,0 20,0 20,0 0,025
4 2
b
vine
a
Alors que les transitions des masses sont censées rester les mêmes d’une plate-forme d’instrument à l’autre, il peut être
nécessaire d’ajuster les autres paramètres pour maximiser la sensibilité.
b
Indique la transition primaire utilisée lors de la quantification.
8.3.4 Équilibrage du CL-SM/SM
L’instrument doit être maintenu dans les conditions d’origine (avec un débit de phase mobile en marche
et le SM à température) pendant 30 min à 60 min avant l’injection. Dans le même but, il est également
possible d’utiliser des 6 à 10 injections de blancs au début d'une séquence.
8.4 Contrôle qualité
8.4.1 Généralités
Encadrer chaque courbe d'étalonnage avec des blancs de solution de formiate d’ammonium (6.1.7)
pour pouvoir contrôler le bruit de fond du laboratoire et la contamination croisée des instruments. Il
convient que le bruit de fond ne dépasse pas 5 % du signal de l'étalon de travail de plus bas niveau.
8.4.2 Courbe d’étalonnage
Les c
...
Questions, Comments and Discussion
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