ISO 16778:2015
(Main)Water quality — Calanoid copepod early-life stage test with Acartia tonsa
Water quality — Calanoid copepod early-life stage test with Acartia tonsa
ISO 16778:2015 specifies an early-life stage test procedure for determination of the toxic effects of a chemical substance, effluent, or water sample on a cold-water marine and brackish water copepod species under semi-static conditions. The biological endpoints include survival and development of the early-life stages. The exposure starts with eggs and is continued until emergence of juvenile stages. Copepods occur widely in marine, brackish, and fresh water ecosystems. They represent important prey items for the larvae of many fish and larger invertebrates and are increasingly used as a live food source in aquaculture. They feed on phytoplankton and, thus, are an ecologically important energy-transfer link between primary producers and higher trophic levels.
Qualité de l'eau — Essai aux premiers stades de la vie de copépodes calanoïdes avec Acartia tonsa
ISO 16778:2015 spécifie un mode opératoire d'essai aux premiers stades de la vie pour la détermination, en conditions semi-statiques, des effets toxiques d'un échantillon de substance chimique, d'effluent ou d'eau sur une espèce de copépode d'eaux marines froides et d'eaux saumâtres. Les critères d'effet biologiques incluent la survie et le développement des animaux aux premiers stades de leur vie. L'exposition commence avec les ?ufs et se poursuit jusqu'à l'émergence des stades juvéniles. Les copépodes sont des espèces largement répandues dans les écosystèmes marins, saumâtres et d'eau douce. Ils constituent des proies importantes pour les larves de nombreuses espèces de poissons et de grands invertébrés et sont de plus en plus utilisés comme source d'alimentation vivante en aquaculture. Se nourrissant de phytoplancton, ils représentent un maillon écologique important en ce qui concerne le transfert d'énergie entre les producteurs primaires et les niveaux trophiques supérieurs.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16778
First edition
2015-06-15
Water quality — Calanoid copepod
early-life stage test with Acartia
tonsa
Qualité de l’eau — Essai aux premiers stades de la vie de
copépodes calanoïdes avec Acartia tonsia
Reference number
©
ISO 2015
© ISO 2015, Published in Switzerland
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ii © ISO 2015 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Apparatus . 2
6 Reagents . 3
6.1 Water . 3
6.2 Culture and test media . 3
6.3 Dilution water . 3
7 Test organism . 3
8 Procedure. 4
8.1 Preparation of culture medium . 4
8.2 Choice of test concentrations . 4
8.3 Preparation of test substance stock solution . 4
8.4 Preparation of test solutions . 5
8.5 Incubation/Exposure . 5
8.5.1 Test organisms and loading . 5
8.5.2 Control of hatching . . 5
8.5.3 Larval development ratio (Early-life stages development). 6
8.5.4 Duration. 6
8.5.5 Handling of test vessels . 6
8.5.6 Feeding . 6
8.5.7 Light and temperature . 6
8.5.8 Aeration . 6
8.5.9 Dilution water and test solutions renewal or addition . 6
8.6 Measurements/Observations . 7
8.6.1 Concentration of the test substance . 7
8.6.2 Physical-chemical parameters .
oxygen, pH, salinity, and temperature . 8
9 Validity criteria . 8
10 Expression of results . 8
11 Denotion of results . 9
12 Interpretation of results . 9
13 Reference substance . 9
14 Test report . 9
Annex A (informative) Defined culture and test media .11
Annex B (informative) Specific details on renewal of test solution, feeding regime, and an
example of a flow diagram for a larval development test (early-life stage test) with
Acartia tonsa .13
Annex C (informative) Sampling for chemical analyses .17
Annex D (informative) Lugol’s solution .18
Annex E (informative) Data collection sheet for Acartia tonsa early-life stage test .19
Annex F (informative) Calculations .21
Annex G (informative) Culturing of Acartia tonsa .23
Annex H (informative) Specific details on secondary sexual characteristics for Acartia tonsa .28
Annex I (informative) General safety precautions and techniques for handling
environmental samples .30
Bibliography .36
iv © ISO 2015 – All rights reserved
Foreword
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through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
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Biological methods.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16778:2015(E)
Water quality — Calanoid copepod early-life stage test with
Acartia tonsa
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associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
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IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies an early-life stage test procedure for determination of the
toxic effects of a chemical substance, effluent, or water sample on a cold-water marine and brackish
water copepod species under semi-static conditions. The biological endpoints include survival and
development of the early-life stages. The exposure starts with eggs and is continued until emergence of
juvenile stages.
Copepods occur widely in marine, brackish, and fresh water ecosystems. They represent important prey
items for the larvae of many fish and larger invertebrates and are increasingly used as a live food source
in aquaculture. They feed on phytoplankton and, thus, are an ecologically important energy-transfer
link between primary producers and higher trophic levels.
2 Normative references
There are no normative references cited in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
EC
effect concentration
3.2
EC
x
calculated concentration from which an effect of x % is expected
3.3
larval development ratio
LDR
fraction of animals that have turned into a copepodite stage compared to the total number of surviving
nauplii and copepodites within a given period of time (5 d to 6 d)
3.4
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest concentration within the experimental range at which a significant effect is observed
3.5
no observed effect concentration
NOEC
tested concentration just below the LOEC
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.18]
3.6
x % confidence intervals
interval of values within which the measured or calculated value is likely to be present with a
probability of x %
3.7
dilution water
water with defined properties (e.g. salinity) or natural seawater used for stepwise dilution of the test
sample or used as control
4 Principle
The test is an early-life stage test, where the organisms are exposed to various concentrations of a
chemical substance, effluent, or water sample, from the egg stage to the juvenile stages. Survival and
development of early-life stages [larval development ratio (LDR)] are dependent on the investigated
parameters. The total test duration is about 5 d to 6 d, which is sufficient time to investigate the
development from nauplii to copepodites.
The naupliar (larval) and copepodite (juvenile) stages are morphologically distinct, and therefore, the
transition from the last naupliar to the first copepodite stage is easily observed. Larval development
ratio (LDR) is recorded after 5 d to 6 d, when about 60 % of the control animals have reached a copepodite
stage, and is expressed as the ratio of copepodites to the total number of surviving early-life stages
(nauplii + copepodites) at the end of the LDR test. Hatching success and mortality of the early stages
should be presented along with the LDR.
The outcome of the test is either the no observed effect concentration and the lowest observed effect
concentration (NOEC-LOEC) values or the effect concentrations with a certain degree (x %) of inhibition
(EC ) (e.g. EC and EC ).
x 50 10
5 Apparatus
Test vessels and other apparatus, which will come into contact with the dilution water and test solutions,
should be made entirely of glass or other materials chemically inert to the test chemical.
5.1 Standard laboratory apparatus, e.g. measurements of pH, dissolved oxygen concentration,
salinity, and temperature.
5.2 Glass flasks, volume 1 l, 2 l, and 5 l.
5.3 Air pumps.
5.4 Air filters, pore size 0,2 µm.
5.5 Peristaltic pump for food supply.
5.6 Temperature-controlled cabinet or room.
5.7 Low-magnifying stereomicroscope, preferably with dark field illumination.
2 © ISO 2015 – All rights reserved
5.8 Apparatus for membrane filtration.
5.9 Filters, 0,2 µm (6.2) and eventually filters with grids (8.5.1).
5.10 Nets, mesh sizes 50 µm and 180 µm to 200 µm, for isolation of eggs, for capture and transfer of
animals, and as filters when medium is changed.
5.11 Adequate apparatus for the control of the lighting regime.
6 Reagents
6.1 Water
All water used in preparation of culture medium shall be clean natural seawater or deionized water
or of equivalent purity. Take special care to avoid contamination of the water by inorganic or organic
substances during preparation and storage.
Equipment made of copper shall not be used.
6.2 Culture and test media
Culture and test media are prepared from either reconstituted salt water or filtered (0,2 µm) natural
marine water from an unpolluted location. An example of reconstituted salt water suitable for cultivation
and testing is given in Annex A. Reconstituted salt water media with a known composition in which the
copepods show suitable long-term survival, normal behaviour, development, and fecundity can be used
as culture and test media, i.e. dilution water.
6.3 Dilution water
The salinity of the dilution water should be the same as that of the culture medium (see Annex A). The
dilution water shall have a dissolved oxygen concentration above 70 % of the air saturation value and a
pH of 8,0 ± 0,3 before being used to prepare the test solutions. If there is evidence of marked change of
pH at the highest test concentration, it is advisable to adjust the pH of the stock solution/environmental
sample to that of the dilution water before preparing the dilution series. The pH adjustment of the stock
solution or test concentrations shall not change the concentration to any significant extent or lead to
chemical reaction or precipitation of the test substance. HCl and NaOH are preferred for pH adjustments.
If the physical conditions or the salinity of the salt water to be used in the test differ more than 5 °C in
temperature or 10 ‰ salinity from those used for routine culturing, it is good practice to include an
adequate pre-test acclimation period at the same temperature (20 ± 1) °C and salinity (20 ± 2) ‰ of 2
to 3 weeks to avoid stressing the eggs and animals. Use of another temperature or salinity, which can be
more appropriate in oceanic or brackish water situations, shall be justified in the test report.
7 Test organism
The species to be used is the marine calanoid copepod Acartia tonsa Dana (see Annex G and Annex H).
Eggs used in the test should be collected from a healthy stock (i.e. showing no signs of stress such as
high mortality, poor fecundity, etc.). The stock animals shall be maintained in culture conditions (light,
temperature, medium, and feeding) similar to those to be used in the test (culturing method for A. tonsa
is described in Annex G).
8 Procedure
8.1 Preparation of culture medium
Natural seawater or a reconstituted medium can be used. A suitable reconstituted culture medium is
described in Annex A. However, alternative reconstituted media can be used as long as the validity
criteria for the test are met (see Clause 9). The defined medium described in Annex A contains a
chelating agent and therefore, might not be appropriate for testing of samples that contain metals. The
salinity can be varied by choosing a desired amount of the 10 % salinity solution. The salinity of natural
seawater and environmental samples can be raised by using the same 10 % salinity solution (Table A.1)
or lowered by adding an appropriate volume of M7 (see Reference [1] and Annex A) or deionized water.
8.2 Choice of test concentrations
[1]
Prior knowledge of the toxicity of the test substance (e.g. from an acute test ) or from range-finding
studies) should help in selecting appropriate test concentrations. As a rule of thumb, the highest
concentration in the early-life stage test should be chosen within the interval between LC and LC of
10 20
the acute 48 h test to avoid significant effect on survival.
At least 5 different concentrations should be tested in a geometric series with a factor between
concentrations not exceeding 3,2. Justification should be provided if fewer than five concentrations are
used. Substances should not be tested above their solubility limits in dilution water. A dilution water
control shall be included and, if a solvent is used, a solvent-control shall also be included (8.3), containing
the same concentration of solvent as the test series.
If there are substantial reason to assume that a high concentration of a chemical or an environmental
sample will have low/no toxicity at a high concentration (e.g. at 10 mg/l or 100 ml/l), the early-life stage
test can be performed as a limit test, using a test concentration of, for example, 10 mg/l (or 100 ml
sample/l) and the control. The usual number of replicates should be used for both the treatment and
the control groups. A limit test can show that there is no statistically significant effect at the limit
concentration when compared to the controls, but if significant effects are recorded, a full test will
normally be required.
8.3 Preparation of test substance stock solution
The test solutions are usually prepared by diluting a stock solution of a test chemical or of an
environmental sample with dilution water. Stock solutions of chemicals shall be prepared by dissolving
the substance in dilution water. The preferred options for preparing test solutions are physical methods,
[2][3]
such as stirring and sonication. Saturation columns (solubility columns) can be used for achieving
a suitably concentrated stock solution.
The use of organic solvents might be required in some cases in order to produce a suitably concentrated
stock solution, but every effort should be made to avoid the use of such carrier solvents. The only
recommended solvent for this test is acetone. Acetone shall be used to produce a stock solution that
can be dosed accurately into water. The recommended maximum acetone concentration in the dilution
water and test solutions is 0,01 ml/l. The concentration shall be the same in all test vessels. If another
solvent or a higher acetone concentration is used, it shall be documented that it has no effects. Acetone
will not be toxic at 0,01 ml/l and will not increase the water solubility of a substance. Acetone might
be essential in handling some substances; for example, for preparing stock solutions of hydrolytically
[4]
unstable or highly viscous substances.
4 © ISO 2015 – All rights reserved
8.4 Preparation of test solutions
1)
In the LDR test, the control should comprise of at least 10 control replicates and preferably more, and
as a minimum 6 replicates of each test concentration. The demand for replicates is higher if the ANOVA
statistic is used whereas regression analysis generally demands more concentrations.
The number of replicates depends on the statistical endpoint (ANOVA or EC ). When planning the test, it
x
should be taken into consideration whether the aim is to achieve a NOEC/LOEC (by use of ANOVA) or an
EC value (by use of regression technique).
x
For the use of ANOVA technique or regression analysis, see Reference [5].
In setting the range of concentrations, the following should be borne in mind:
If the aim is to obtain the NOEC, the lowest test concentration shall be low enough so that the biological
endpoint at that concentration is not significantly different from that of the control. If this is not the
case, the test will have to be repeated with a reduced lowest concentration. If the aim is to obtain the
NOEC, the highest test concentration shall be high enough to cause a statistically significant effect when
compared to the control on the biological endpoint. If this is not the case, the test will have to be repeated
with an increased highest concentration.
If EC for effects on development is estimated, it is optimal that the lowest concentration has no
x
effects (optimally the only one without effects), and the highest concentration is greater than EC ,
and that sufficient concentrations are used to define the EC with the appropriate level of confidence.
x
If the highest concentration is below the EC , it is recommended also to report the EC and/or the
50 10
NOEC/LOEC values.
The range of test concentrations should preferably not include any concentrations that have a significant
effect on survival since the main objective of the test is to measure sublethal effects (e.g. development).
8.5 Incubation/Exposure
A recommended schedule for an early-life stage test is given in Annex B.
8.5.1 Test organisms and loading
Fresh eggs produced by the copepod stock culture are preferred but eggs stored for a maximum of one
week at 4 °C can be used (see Table B.1). 60 to 90 eggs are counted by use of a stereomicroscope and
added to the test solution in each test vessel. Eggs shall be counted individually on a filter with grids or
in a drop of water (filters and water drops can be placed in a Petri dish with marked graduations) and
after counting be flushed into the test vessel (see Table B.1).
Newly hatched nauplii present at counting can be crushed with a preparation needle while counting
the eggs or if added together with the eggs, the nauplii shall be counted as well. The number of newly
hatched nauplii shall not exceed 5 % of the number of added eggs.
A data collection sheet suitable for holding the recorded data are given in Annex E.
8.5.2 Control of hatching
Complementary to the LDR control vessels, an additional control for hatching may be set up. Four
replicates with 60 to 90 eggs in 40 ml to 80 ml (same volume as in test replicates – see 8.5.3) of dilution
water are started at the same time as the LDR test with eggs from the same batch (see Table B.1). This
hatching control will only run for 2 d to 3 d and, at that time, the number of larvae and unhatched eggs
are counted to check the hatching percentage.
1) It is recommended to start with at least 12 control replicates since some will probably be used for inspection of
the development at a time where the LDR is below the 60 % ±20 % criterion for the copepodite fraction. To find the
optimal time to terminate the LDR test 1 to 2, controls are taken and counted at regular intervals when it is expected
that the LDR approaches 60 %.
8.5.3 Larval development ratio (Early-life stages development)
Eggs (60 to 90) are exposed in each replicate vessel holding the same volume of test solution (40 ml
to 80 ml). The exact number of eggs (and newly hatched nauplii) added is recorded. Test solutions are
renewed on day 2 or 3 or the volume is increased by adding new test solution using the principle from
Footnote 3 (see also Annex B, Table B.1). Observation of the larval development is normally recorded
after 5 d to 6 d, when about 60 % of the control animals have reached a copepodite stage, and is expressed
as the ratio of copepodites to the total number (sum) of larvae (nauplii) and juveniles (copepodites) alive
at that point of the test. Animals dying during the test disappear quickly and all animals counted at the
end of the test are assumed to be alive when Lugol’s solution is added (see 8.6 and Annex D). Additional
replicates of the controls should be prepared to catch the most optimal time for stopping the test as
close as possible to the 60 % copepodite ratio (see Footnote 1). Mortality (animals dead and missing
during the test) should be presented along with the LDR (see Annex F for calculation examples).
8.5.4 Duration
Time needed to complete (at 20 °C and 20‰ salinity) larval development test is 5 d to 6 d. At lower
temperatures or higher salinities, the development might be slower and, thus, testing at these conditions
might last longer. See, for example, Reference [6] which presents a study of the length of time elapsed
until 50 % of the early-life stages reach a copepodite stage at different salinity and temperature regimes.
8.5.5 Handling of test vessels
Handling of the test vessels should be done in a random fashion. Failure to do this may result in bias
that could be construed as being a concentration effect. In particular, if experimental units are handled
in treatment or concentration order, some time-related effect, such as operator fatigue or other error,
could lead to greater effects at the higher concentrations. Care should be taken that environmental
conditions, such as position in the laboratory, are uniform for all test vessels independently of their
physical position in the test setup. It is also important to stress that the time given for each replicate to
develop is the same for all the replicates.
8.5.6 Feeding
4 −1
5.0 × 10 cells · ml of Rhodomonas salina should be added at the start of the test and at renewals or
addition of new test solution (see 8.5.9 and Table B.1). Deviations from this should be reported. When
using small volumes of test solution in semi-static tests, it is important to consider the volume of food
fed and the dilution of the exposure concentration. Food should be added at a volume that does not
exceed 1 % of the total volume. Specific details of the feeding regimes are given in Table B.1.
8.5.7 Light and temperature
Specific details of the light and temperature regimes to be used are described in Annex G. A photoperiod
-1 -2
of 16:8 h light:dark is recommended at a low light intensity (5 µmol to 10 µmol · s · m ). The temperature
used shall be 20 °C ± 1 °C during the entire exposure period.
8.5.8 Aeration
If aeration is necessary to keep dissolved oxygen concentration (DO) > 70 % of the air saturation value
(ASV) (see Clause 9), test vessels should be aerated as little as possible to avoid evaporation of water and
stripping of test chemicals.
8.5.9 Dilution water and test solutions renewal or addition
The frequency of partial test solution renewal or addition will depend on the stability of the test
substance, but should be at least once during a 5 d to 6 d test, and at least every 2 d to 3 d, if the duration is
longer. If, from preliminary stability tests or from the physico-chemical properties of the test substance,
concentration is evaluated not to be stable (i.e. outside the range 80 % to 120 % of nominal or falling
below 80 % of the measured initial concentration) over the maximum renewal period (i.e. 2 d to 3 d),
6 © ISO 2015 – All rights reserved
consideration should be given to more frequent test solution renewals. There shall be evidence that the
concentration of the test substance has been satisfactorily maintained (see 8.6).
When the test solution is renewed, the following are the different ways to do this:
2)
— part (50 % to 80 %) of the old test solution can be replaced by fresh test solution
;
3)
— the volume can be increased gradually by adding fresh test solution .
Another method could be to prepare a series of test vessels with fresh test solution and transfer the animals
to them by, for example, having an inner chamber supplied with fine net of suitable mesh size as a bottom.
8.6 Measurements/Observations
In the LDR test, numbers of unhatched eggs, nauplii (larvae), and copepodites (juveniles) shall be recorded
at the end of the exposure period. The animals and unhatched eggs are fixed in Lugol’s solution and
studied (counted, measured, etc.). Since Lugol’s solution may also oxidize the test chemical, samples for
chemical analysis shall be taken before addition of Lugol’s solution and preferably from separate vessels
prepared for this purpose only (Annex D). Staining (and killing off all animals) in Lugol’s solution (see
Annex D) will facilitate counting of animals and unhatched eggs. Counting of different developmental
stages of A. tonsa needs to be facilitated by the use of a stereomicroscope.
Observations made during the test should be recorded on data collection sheets. Examples are
provided in Annex E.
8.6.1 Concentration of the test substance
During the test, the concentrations of test substance should be determined at regular intervals. It is
recommended that, as a minimum, the highest and lowest test concentrations are analysed when freshly
prepared - at the start of the test and immediately prior to renewals and at the end of the test (i.e.
analyses should be made on samples from the same concentration – when freshly prepared, at renewal
and at the end). To avoid biological materials and Lugol’s solution in the samples for chemical analysis,
it is recommended to set up three extra vessels of each concentrations for sampling purposes (without
organisms and food); one to be harvested before first renewal or addition of water, another one to be
harvested after first renewal or addition of water, and the last one to be harvested at the end. At the
start, samples for analysis are achieved from the same portions as used to start the test. See Annex C.
If there is evidence that the concentration of the substance being tested has been satisfactorily
maintained within ±20 % of the nominal/measured concentration throughout the test, then results can
be based on nominal or measured values. If the deviation from nominal or measured concentration is
greater than ±20 %, results should be expressed in terms of the time-weighted mean (see guidance for
calculation in Annex F).
For tests, in which the concentration of the test substance is not expected to remain within ±20 % of the
nominal concentration, it is necessary to sample all test concentrations (including control) when freshly
prepared and at renewal. After finalizing the tests, at least samples with nominal concentrations close
to EC , EC and NOEC are analysed. In these cases, calculations of effect concentrations are based
10 50,
on the measured concentrations, and results should be expressed in terms of the time-weighted mean
(see guidance for calculation in Annex F). Note that care should be taken when testing very lipophilic
(i.e. log K > 5) and hence, poorly water-soluble substances in the present test system (see Reference
ow
[3]). Using radiolabelled substances may give crucial information on the partitioning in the test system,
which may facilitate the calculation of the actual concentrations.
2) Test solution can be removed with a siphon supplied with a net with an appropriate mesh size to avoid removal
of animals or eggs from the test vessel.
3) Fresh test solution can be added by increasing the volume in the test vessels gradually from (for example) 40 ml
at the start to 80 ml on day 2 or 3.
8.6.2 Physical-chemical parameters – oxygen, pH, salinity, and temperature
Dissolved oxygen, pH, salinity, and temperature should be measured in the control and all test
concentrations at start and end of test, and each time dilution water is renewed. As a minimum, these
measurements shall be made in the control and the highest test concentration. Temperature should
preferably be monitored continuously. Additional test vessels (including animals and food) may be set
up for this purpose only.
9 Validity criteria
For a test to be valid, the following performance criteria should be met:
— the dissolved oxygen concentration must have been at least 70 % of the air saturation value (ASV)
throughout the exposure period;
— temperature should vary no more than ±1 °C during the entire test period;
— control pH shall not vary more than 1,0 unit from the initial control pH;
— conductivity/salinity shall not vary more than 10 % from the control start value [e.g. (20 ± 2) ‰];
— hatching success in the control shall be ≥75 %;
— in LDR tests, the average control copepodite fraction (LDR) shall be (60 ± 20) % of the counted
animals at the end of the exposure;
— in LDR tests, average surviving percentage of animals in the control(s) on the day of observation of
LDR shall be ≥70 % of the hatched animals;
— the EC of the reference compound 3,5-Dichlorophenol (3,5-DCP) shall be within the range of
500 µg/l ± 300 µg/l for tests performed at 20 °C and 20 ‰ salinity.
10 Expression of results
One-way nested analysis of variance (ANOVA) or regression analysis technique is used to evaluate effects
of the test substance on the development of the copepods. Analysis of variance is a parametric procedure
and is based on the assumptions that the observations are independent and normally distributed and
that the variance of the observations is homogeneous across all toxicant concentrations and the control.
These assumptions should be checked prior to using ANOVA, to determine if they have been met. Tests for
validating these assumptions are Shapiro-Wilk’s test for normality and Bartlett’s Test for homogeneity
[7]
of variance. If the data do not meet the assumptions for ANOVA, non-parametric procedures such
[7]
as Steel’s Many-One-Rank Test or Wilcoxon’s Rank Sum Test might be more appropriate. Different
programs are available for performing linear or nonlinear regression assuming a logarithmic normal
distribution, a Weibull distribution, or a logit distribution of data.
If a limit test (comparison of control and one treatment only) has been performed and it fulfills the
prerequisites of parametric test procedures (normality, homogeneity), the responses of the two groups
can be evaluated by the Student test (t-test). If the prerequisites for the t-test are not fulfilled, an unequal
[8] [9]
variance t-test (such as Welch test ) or a non-parametric test such as the Mann-Whitney-U-test can
be used. A comparison of the control and the solvent control can be performed in the same way.
If a statistically significant difference in survival or development is detected between the control and
solvent control, only the solvent control is used as the basis for the calculation of results. If no significant
differences exist between control and solvent control data, these can be pooled for comparison with test
substance treatments.
8 © ISO 2015 – All rights reserved
11 Denotion of results
Denote concentrations causing 10 % and 50 % inhibition based on a concentration-response curve as
EC and EC , respectively. Quote EC , EC , NOEC, and LOEC values to two significant digits, normally
10 50 10 50
in milligrams per litre (mg/l) for chemicals or in ml sample/l for environmental samples.
12 Interpretation of results
EC , EC and NOEC values are toxicological data derived from a laboratory experiment carried out under
10 50,
defined conditions. They give an indication of potential hazard of the toxicant/environmental sample, but
cannot be used directly to predict effects in the natural environment (see References [10] and [11]).
13 Reference substance
A reference substance (e.g. 3,5-Dichlorophenol, purity ≥99 %) can be tested periodically as a means of
assuring that the test protocol and test conditions are reliable. Recommended concentrations to test at
20 °C and 20 ‰ salinity are 0 µg/l, 100 µg/l, 200 µg/l, 400 µg/l, 800 µg/l, and 1 600 µg/l.
14 Test report
This test report shall contain at least the following information:
a) the test method used, together with a reference to this International Standard, i.e. ISO 16778:2015;
b) all information required for the complete identification of the sample or of the test substance under
test including the following methods for preparation of the test samples:
1) for effluents, waters, and aqueous extract, the method and storage time of samples etc.;
2) for chemical substances, the method of preparation of stock and test solutions, including the
following:
— relevant physico-chemical properties;
— chemical identification data (name, structural formula, CAS number, etc.) including purity;
— analytical method for quantification of the test substance where appropriate;
c) the test species:
— supplier or source (if known) and the culture conditions used;
d) the following test conditions:
— exposure procedure used (e.g. semi-static);
— photoperiod and light intensity;
— test design (e.g. test concentrations used, number of replicates, number of organisms per
replicate, etc.);
— method of preparation of stock solutions and frequency of renewal (the solvent carrier and its
concentration shall be given, when used);
— the nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard
deviations in the test vessels and the method by which these were attained and evidence that
the measurements refer to the concentrations of the test substance in true solution;
— test solution characteristics (including pH, salinity, temperature, dissolved oxygen concentration,
and any other measurements made);
— detailed information on feeding (e.g. type of food, source, amount given, frequency of feeding);
— analyses for relevant contaminants in water (e.g. metals, PCBs, PAHs, and organochlorine pesticides);
e) the following test results:
— results from any preliminary studies on the stability of the test substance;
— the nominal test concentrations and the results of all chemical analyses to determine the
concentration of the test substance in the test vessels; the recovery efficiency of the analytical
method and the limit of detection should also be reported;
— water quality within test vessels (i.e. salinity, pH, temperature, and dissolved oxygen
concentration);
— a full record of all the biological effects, observed or measured, and the statistical techniques
used to analyse the data;
— the lowest observed effect concentration (LOEC) and no observed effect concentration
(NOEC) for all biological endpoints employed or EC s and statistical methods used for their
x
determination;
— other observed effects;
— explanation of any deviation from this International Standard.
10 © ISO 2015 – All rights reserved
Annex A
(informative)
Defined culture and test media
Table A.1 — Composition of 10 % salinity reconstituted salt water
10 % salinity salt water
Substance g/l
NaCl 70,100
Na SO 11,700
2 4
KCl 2,030
KBr 0,293
Na B O ,10H O 0,113
2 4 7 2
MgCl ,6H O 31,700
2 2
CaCl ,6H O 6,600
2 2
SrCl ,6H O 0,066
2 2
Table A.2 — Bicarbonate stock solution for salt water medium
Final concentration in salt
water medium
g/l ml stock/l mg/l
NaHCO 2,83 1,0 2,83
NaHCO added directly to the salt water medium as addition to the 10 % salinity water will cause
precipitations.
Table A.3 — Trace stock solution for M7 medium - Prepared from Stocks No 1 to No 14
Trace element stock solutions
Stock No Trace element In stock 1 to 14 For trace In trace In final M7
compounds respectively stock stock medium
mg/l ml/l µmol µmol
1 H BO 14 297,50 1,00 231,23 11,56
3 3
2 MnCl ,4H O 1 802,50 1,00 9,11 0,46
2 2
3 LiCl 1 530,00 1,00 36,09 1,80
4 RbCl 355,00 1,00 4,15 0,21
5 SrCl ,6H O 760,00 1,00 2,85 0,14
2 2
6 NaBr 80,00 1,00 0,78 0,039
7 Na MoO ,2H O 315,00 1,00 1,30 0,065
2 4 2
8 CuCl ,2H O 83,75 1,00 0,49 0,025
2 2
9 ZnCl 260,00 1,00 1,91 0,095
10 CoCl ,6H O 200,00 1,00 0,84 0,042
2 2
a
Autoclaved immediately.
Table A.3 (continued)
Trace element stock solutions
Stock No Trace element In stock 1 to 14 For trace In trace In final M7
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16778
Première édition
2015-06-15
Qualité de l’eau — Essai aux premiers
stades de la vie de copépodes
calanoïdes avec Acartia tonsia
Water quality — Calanoid copepod early-life stage test
with Acartia tonsa
Numéro de référence
©
ISO 2015
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l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Appareillage . 2
6 Réactifs . 3
6.1 Eau . 3
6.2 Milieux de culture et d’essai . 3
6.3 Eau de dilution . 3
7 Organisme pour essai . 3
8 Mode opératoire. 4
8.1 Préparation du milieu de culture . 4
8.2 Choix des concentrations d’essai . 4
8.3 Préparation de la solution mère des substances d’essai . 4
8.4 Préparation des solutions d’essai . 5
8.5 Incubation/Exposition . 5
8.5.1 Organismes pour essai et charge . 5
8.5.2 Témoin d’éclosion . 6
8.5.3 Taux de développement larvaire (développement des premiers stades de la vie) 6
8.5.4 Durée . 6
8.5.5 Manipulation des récipients d’essai . 6
8.5.6 Alimentation . 6
8.5.7 Lumière et température . 7
8.5.8 Aération . 7
8.5.9 Eau de dilution, renouvellement ou addition des solutions d’essai . 7
8.6 Mesurages/observations . 7
8.6.1 Concentration de la substance d’essai . 8
8.6.2 Paramètres physico-chimiques .
oxygène, pH, salinité et température . 8
9 Critères de validité . 8
10 Expression des résultats. 9
11 Représentation des résultats. 9
12 Interprétation des résultats . 9
13 Substance de référence . 9
14 Rapport d’essai .10
Annexe A (informative) Milieux de culture et d’essai définis .12
Annexe B (informative) Détails spécifiques concernant le renouvellement de la solution
d’essai et le régime d’alimentation, et exemple d’organigramme pour un essai de
développement larvaire (essai aux premiers stades de la vie) avec Acartia tonsa .14
Annexe C (informative) Échantillonnage en vue des analyses chimiques .18
Annexe D (informative) Solution de Lugol .19
Annexe E (informative) Feuille de collecte de données pour l’essai aux premiers stades de
la vie d’Acartia tonsa .20
Annexe F (informative) Calculs .22
Annexe G (informative) Culture d’Acartia tonsa .25
Annexe H (informative) Détails spécifiques concernant les caractéristiques sexuelles
secondaires d’Acartia tonsa .31
Annexe I (informative) Précautions de sécurité générales et techniques de manipulation
des échantillons environnementaux .33
Bibliographie .39
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité 5,
Méthodes biologiques.
NORME INTERNATIONALE ISO 16778:2015(F)
Qualité de l’eau — Essai aux premiers stades de la vie de
copépodes calanoïdes avec Acartia tonsia
AVERTISSEMENT — Il convient que les personnes utilisant la présente Norme internationale
connaissent bien les pratiques normales de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas
pour but de traiter tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation.
L’utilisateur est tenu d’établir des pratiques de sécurité et d’hygiène appropriées et de s’assurer
de leur conformité aux réglementations nationales existantes.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient exécutés par un personnel suffisamment formé.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie un mode opératoire d’essai aux premiers stades de la vie
pour la détermination, en conditions semi-statiques, des effets toxiques d’un échantillon de substance
chimique, d’effluent ou d’eau sur une espèce de copépode d’eaux marines froides et d’eaux saumâtres.
Les critères d’effet biologiques incluent la survie et le développement des animaux aux premiers stades
de leur vie. L’exposition commence avec les œufs et se poursuit jusqu’à l’émergence des stades juvéniles.
Les copépodes sont des espèces largement répandues dans les écosystèmes marins, saumâtres et d’eau
douce. Ils constituent des proies importantes pour les larves de nombreuses espèces de poissons et de
grands invertébrés et sont de plus en plus utilisés comme source d’alimentation vivante en aquaculture.
Se nourrissant de phytoplancton, ils représentent un maillon écologique important en ce qui concerne le
transfert d’énergie entre les producteurs primaires et les niveaux trophiques supérieurs.
2 Références normatives
Aucune référence normative n’est citée dans le présent document.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
CE
concentration avec effet
3.2
CEx
concentration calculée pour laquelle un effet de x % est prévu
3.3
taux de développement larvaire
LDR
fraction des animaux ayant atteint un stade copépodide par rapport au nombre total de nauplies et
copépodites survivants dans une période de temps donnée (5 j à 6 j)
3.4
concentration minimale avec effet observé
CMEO
plus faible concentration de la plage expérimentale à laquelle un effet significatif est observé
3.5
concentration sans effet observé
CSEO
concentration d’essai juste en dessous de la CMEO
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.18]
3.6
intervalles de confiance de x %
intervalle de valeurs dans lequel la probabilité de trouver la valeur mesurée ou calculée est de x %
3.7
eau de dilution
eau ayant des propriétés définies (par exemple, salinité) ou eau de mer naturelle utilisée pour la dilution
échelonnée de l’échantillon d’essai ou comme témoin
4 Principe
L’essai est un essai aux premiers stades de la vie, où les organismes sont exposés à différentes
concentrations d’une substance chimique, d’effluent ou d’eau, du stade d’œufs aux stades juvéniles.
La survie et le développement des premiers stades de la vie [taux de développement larvaire (LDR)]
dépendent des paramètres étudiés. La durée totale de l’essai est de 5 jours à 6 jours environ, ce qui donne
suffisamment de temps pour étudier le développement des stades naupliens aux stades copépodites.
Les stades naupliens (larves) et copépodites (juvéniles) présentent des morphologies distinctes; par
conséquent, il est aisé d’observer la transition du dernier stade nauplien au premier stade copépodite.
Le taux de développement larvaire (LDR) est enregistré au bout de 5 jours à 6 jours, lorsque 60 %
environ des animaux témoins ont atteint un stade copépodite. Il est exprimé comme étant le rapport des
copépodites au nombre total de survivants aux premiers stades de la vie (nauplies + copépodites) à la
fin de l’essai de développement larvaire. Il convient de mentionner, avec le LDR, les éclosions réussies et
la mortalité aux premiers stades de la vie.
L’essai donne pour résultat soit les valeurs de la concentration sans effet observé et de la concentration
minimale avec effet observé (CSEO-CMEO), soit les concentrations d’effet donnant lieu à un certain degré
(x %) d’inhibition (CEx) (par exemple, CE et CE ).
50 10
5 Appareillage
Il convient que les récipients d’essai et autres matériels destinés à entrer en contact avec l’eau de dilution
et les solutions d’essai soient entièrement fabriqués en verre ou autres matériaux chimiquement inertes
vis-à-vis de la substance chimique d’essai.
5.1 Appareillage courant de laboratoire, par exemple pour le mesurage du pH, de la concentration
en oxygène dissous, de la salinité et de la température.
5.2 Fioles en verre, d’une capacité de 1 l, 2 l et 5 l.
5.3 Pompes à air.
5.4 Filtres à air, porosité de 0,2 µm.
5.5 Pompe péristaltique pour l’alimentation.
5.6 Armoire ou pièce à température contrôlée.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
5.7 Stéréomicroscope à faible grossissement, muni de préférence d’un système d’illumination à
fond noir.
5.8 Appareillage pour filtration sur membrane.
5.9 Filtres, 0,2 µm (6.2) et, à la fin, filtres quadrillés (8.5.1).
5.10 Filets, ouverture de maille 50 µm et 180 µm à 200 µm, pour l’isolation des œufs, la capture et le
transfert des animaux; servent de filtres lorsque le milieu est changé.
5.11 Dispositif approprié pour régler le régime d’éclairage.
6 Réactifs
6.1 Eau
L’eau utilisée pour préparer le milieu de culture doit toujours être de l’eau de mer naturelle propre ou de
l’eau déionisée, ou une eau de pureté équivalente. Prendre particulièrement soin d’éviter la contamination
de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation et le stockage.
Aucun matériel en cuivre ne doit être utilisé.
6.2 Milieux de culture et d’essai
Les milieux de culture et d’essai sont préparés soit à partir d’eau de mer synthétique, soit à partir d’eau
de mer naturelle filtrée (0,2 µm) provenant d’un site non pollué. Un exemple d’eau de mer synthétique
appropriée pour la culture et les essais est donné à l’Annexe A. Des milieux constitués d’eau de mer
synthétique de composition connue, se prêtant à la survie à long terme des copépodes et où ces derniers
se comportent, se développent et se reproduisent normalement, peuvent servir de milieux de culture et
d’essai, c’est-à-dire d’eau de dilution.
6.3 Eau de dilution
Il convient que l’eau de dilution ait une salinité identique à celle du milieu de culture (voir Annexe A).
Avant d’être utilisée pour préparer les solutions d’essai, l’eau de dilution doit avoir une concentration
en oxygène dissous supérieure à 70 % de la valeur de saturation dans l’air et un pH de 8,0 ± 0,3. Si un
changement notable du pH à la concentration d’essai la plus élevée est mis en évidence, il est conseillé
d’ajuster le pH de la solution mère/l’échantillon environnemental au pH de l’eau de dilution avant de
préparer la série de dilutions. L’ajustement du pH de la solution mère ou des concentrations d’essai ne
doit pas induire de changement significatif de la concentration; il ne doit pas non plus entraîner une
réaction chimique ou la précipitation de la substance d’essai. HCl et NaOH sont utilisés de préférence
pour ajuster le pH.
Si, par rapport à une culture de routine, les conditions physiques sont telles que la température de l’eau
de mer devant servir pour l’essai diffère de plus de 5 °C, ou si la salinité diffère de plus de 10 ‰, une
bonne pratique consiste à faire précéder l’essai d’une période adéquate d’acclimatation dans les mêmes
conditions de température (20 ± 1) °C et de salinité (20 ± 2) ‰, d’une durée de 2 semaines à 3 semaines,
pour éviter de stresser les œufs et les animaux. L’utilisation d’une autre température ou d’une autre
salinité pouvant mieux convenir en présence d’eau océanique ou d’eau saumâtre doit être justifiée dans
le rapport d’essai.
7 Organisme pour essai
L’espèce à utiliser est le copépode calanoïde marin Acartia tonsa Dana (voir Annexe G et Annexe H).
Il convient que les œufs utilisés durant l’essai proviennent d’une culture saine (c’est-à-dire une culture ne
présentant aucun signe de stress tel qu’une mortalité élevée, une fécondité médiocre, etc.). Les animaux
de réserve doivent être maintenus dans des conditions de culture (lumière, température, milieu et
alimentation) similaires aux conditions de l’essai (une méthode de mise en culture d’A. tonsa est décrite
à l’Annexe G).
8 Mode opératoire
8.1 Préparation du milieu de culture
Il est possible d’utiliser de l’eau de mer naturelle ou un milieu synthétique. Un milieu de culture synthétique
approprié est décrit à l’Annexe A. Toutefois, il est possible d’utiliser d’autres milieux synthétiques à
condition que les critères de validité de l’essai soient respectés (voir Article 9).Le milieu défini décrit à
l’Annexe A contient un chélateur; il peut donc ne pas convenir aux essais sur des échantillons contenant
des métaux. La salinité peut être modifiée en choisissant une quantité voulue de la solution à 10 ‰ de
salinité. La salinité des échantillons d’eau de mer naturelle et des échantillons environnementaux peut
être augmentée en utilisant la même solution à 10 ‰ de salinité (Tableau A.1) ou diminuée en ajoutant
un volume approprié de M7 (voir Référence [1] et Annexe A) ou d’eau déionisée.
8.2 Choix des concentrations d’essai
Il convient de s’appuyer sur une connaissance préalable de la toxicité de la substance d’essai (par exemple
[1]
à partir d’un essai de toxicité aiguë ou d’études préliminaires) pour sélectionner des concentrations
d’essai appropriées. L’expérience montre qu’il convient de choisir la concentration maximale de l’essai
aux premiers stades de la vie dans l’intervalle compris entre la CL et la CL de l’essai de toxicité aiguë
10 20
en 48 h, ceci afin d’éviter un effet significatif sur la survie.
Il convient de soumettre à essai au moins cinq concentrations différentes en progression géométrique
de raison inférieure ou égale à 3,2. Si l’on utilise moins de cinq concentrations, il convient d’en apporter
la justification. Il convient que les substances ne soient pas soumises à essai au-dessus de leurs limites de
solubilité dans l’eau de dilution. L’essai doit inclure une eau de dilution témoin. Si un solvant est utilisé,
il doit inclure également un témoin contenant un solvant (8.3) en concentration identique à celle de la
série d’essai.
S’il y a matière à supposer qu’une concentration élevée d’une substance chimique ou qu’un échantillon
environnemental à concentration élevée (par exemple, à 10 mg/l ou 100 ml/l) sera peu ou pas du tout
toxique, l’essai aux premiers stades de la vie peut être réalisé en tant qu’essai limite, mettant en œuvre
une concentration d’essai de 10 mg/l (ou 100 ml d’échantillon/l), par exemple, et le témoin. Il convient
d’utiliser le nombre habituel de réplicats pour le groupe de traitement et pour le groupe témoin. Un essai
limite peut montrer l’absence d’effet statistiquement significatif à la concentration limite, comparé aux
témoins. Toutefois, si des effets significatifs sont enregistrés, un essai complet est normalement requis.
8.3 Préparation de la solution mère des substances d’essai
Les solutions d’essai sont habituellement préparées par dilution d’une solution mère d’une substance
chimique d’essai ou d’un échantillon environnemental avec l’eau de dilution. Les solutions mères de
substances chimiques doivent être préparées par dissolution de la substance dans l’eau de dilution. Les
options préférées de préparation des solutions d’essai sont des méthodes physiques, telles que l’agitation
[2][3]
et la sonication . Des colonnes de saturation (colonnes de solubilité) peuvent être utilisées pour
obtenir une solution mère de concentration appropriée.
L’utilisation de solvants organiques peut s’avérer nécessaire dans certains cas pour produire une solution
mère de concentration appropriée; il convient toutefois d’éviter, autant que faire se peut, l’utilisation
de ces solvants porteurs. L’unique solvant recommandé pour cet essai est l’acétone. L’acétone doit être
utilisée pour produire une solution mère pouvant être dosée avec précision dans l’eau. La concentration
maximale d’acétone recommandée dans l’eau de dilution et les solutions d’essai est de 0,01 ml/l. La
concentration doit être identique dans tous les récipients d’essai. Si un autre solvant est utilisé ou
4 © ISO 2015 – Tous droits réservés
si la concentration en acétone est plus élevée, l’absence d’effets doit être démontrée et documentée.
L’acétone n’est pas toxique à la concentration de 0,01 ml/l et n’augmente pas la solubilité d’une substance
dans l’eau. L’acétone peut s’avérer essentielle pour manipuler certaines substances; par exemple, pour
préparer des solutions mères de substances présentant une instabilité hydrolitique ou de substances à
[4]
haute viscosité.
8.4 Préparation des solutions d’essai
1)
Dans l’essai de développement larvaire, il convient que le témoin comprenne au moins 10 réplicats
témoins, et davantage de préférence, et au minimum 6 réplicats de chaque concentration d’essai. Le
besoin en réplicats est plus important si la méthode statistique de l’ANOVA est utilisée, tandis que la
technique de l’analyse de régression requiert généralement plus de concentrations.
Le nombre de réplicats dépend du critère d’effet statistique (ANOVA ou CEx). Lors de la planification de
l’essai, il convient d’apprécier si l’objectif est d’obtenir une valeur de la CSEO/CMEO (par la méthode de
l’ANOVA) ou une valeur de la CEx (par une technique de régression).
Pour l’utilisation de la technique de l’ANOVA ou d’une analyse de régression, voir Référence [5].
En définissant la gamme de concentrations, il convient de garder à l’esprit les points suivants:
Si l’objectif est d’obtenir la CSEO, la concentration d’essai minimale doit être suffisamment faible pour
que le critère d’effet biologique à cette concentration ne diffère pas de manière significative de celui
du témoin. Dans le cas contraire, l’essai devra être répété avec une concentration minimale réduite. Si
l’objectif est d’obtenir la CSEO, la concentration d’essai maximale doit être suffisamment élevée pour
induire un effet statistiquement significatif sur le critère d’effet biologique, comparé au témoin. Dans le
cas contraire, l’essai devra être répété avec une concentration maximale augmentée.
S’il s’agit d’estimer la CEx ayant des effets sur le développement, les conditions optimales sont les
suivantes: la concentration minimale est sans effet (idéalement, la seule sans effet), la concentration
maximale est supérieure à la CE et des concentrations suffisantes sont utilisées pour définir la CEx
avec le niveau de confiance approprié. Si la concentration maximale est inférieure à la CE , il est
recommandé de rapporter également les valeurs de la CE et/ou de la CSEO/CMEO.
Il convient de préférence qu’aucune concentration ayant un effet significatif sur la survie ne soit incluse
dans la gamme de concentrations d’essai puisque l’objet principal de l’essai est la mesure des effets
sublétaux (par exemple, développement).
8.5 Incubation/Exposition
Un calendrier recommandé pour un essai aux premiers stades de la vie est donné à l’Annexe B.
8.5.1 Organismes pour essai et charge
Il est préférable d’utiliser des œufs frais issus de la culture mère de copépodes, mais des oeufs conservés
au maximum une semaine à 4 °C peuvent être utilisés (voir Tableau B.1). 60 œufs à 90 œufs sont comptés
au moyen d’un stéréomicroscope et ajoutés à la solution d’essai dans chaque récipient d’essai. Les œufs
doivent faire l’objet d’un comptage individuel sur un filtre quadrillé ou dans une goutte d’eau (les filtres
et les gouttes d’eau peuvent être placés dans une boîte de Petri graduée); après le comptage, ils doivent
être transvasés dans le récipient d’essai (voir Tableau B.1).
Les nauplies récemment écloses présentes au comptage peuvent être écrasées au moyen d’une aiguille
de préparation pendant le comptage; si elles sont ajoutées avec les œufs, les nauplies doivent être
comptées également. Le nombre de nauplies récemment écloses ne doit pas dépasser 5 % du nombre
d’œufs ajoutés.
1) Il est conseillé de démarrer avec au moins 12 réplicats témoins car certains d’entre eux vont probablement
servir au contrôle du développement à un stade où le LDR est inférieur au critère des (60 ± 20) % pour la fraction de
copépodites. Pour déterminer le meilleur moment d’arrêter l’essai de développement larvaire 1 ou 2, des témoins
sont prélevés et comptés à intervalles réguliers lorsqu’on estime que le LDR s’approche de 60 %.
Une feuille de collecte des données appropriée pour la tenue des données enregistrées figure à l’Annexe E.
8.5.2 Témoin d’éclosion
Un témoin supplémentaire pour l’éclosion peut être prévu en complément des récipients témoins de
l’essai de développement larvaire. Quatre réplicats constitués de 40 ml à 80 ml d’eau de dilution (même
volume que dans les réplicats d’essai – voir 8.5.3) contenant 60 œufs à 90 œufs sont démarrés en même
temps que l’essai de développement larvaire, avec des œufs issus du même lot (voir Tableau B.1). Ce
témoin d’éclosion ne servira que deux jours ou trois jours, au terme desquels le nombre de larves et
d’œufs non éclos sera compté pour contrôler le pourcentage d’éclosion.
8.5.3 Taux de développement larvaire (développement des premiers stades de la vie)
Pour chaque réplicat, les oeufs (60 à 90) sont exposés dans un récipient contenant un volume identique
de la solution d’essai (40 ml à 80 ml). Le nombre exact d’œufs (et de nauplies récemment écloses) est
enregistré. Les solutions d’essai sont renouvelées au jour 2 ou au jour 3, ou le volume est augmenté par
addition de solution d’essai fraîche en suivant le principe de la Note de bas de page 3 (voir également
Annexe B, Tableau B.1). Le taux de développement larvaire observé est normalement enregistré au bout
de 5 jours à 6 jours, lorsque 60 % environ des animaux témoins ont atteint un stade copépodite. Il est
exprimé comme étant le rapport des copépodites au nombre total (somme) de larves (nauplies) et de
juvéniles (copépodites) vivants à ce moment de l’essai. Les animaux qui meurent au cours de l’essai
disparaissent rapidement et tous les animaux comptés à la fin de l’essai sont supposés être vivants
lorsque la solution de Lugol est ajoutée (voir 8.6 et Annexe D). Il convient de préparer des réplicats
supplémentaires des témoins afin de saisir le meilleur moment pour arrêter l’essai au plus près du ratio
de 60 % de copépodites (voir Note de bas de page 1). Il convient d’indiquer la mortalité (animaux morts
et manquants durant l’essai) en même temps que le taux de développement larvaire (voir Annexe F pour
des exemples de calcul).
8.5.4 Durée
La durée totale (à 20 °C et avec une salinité de 20 ‰) de l’essai de développement larvaire est de 5 jours
à 6 jours.À des températures plus basses ou avec des salinités plus élevées, le développement peut être
plus lent, de sorte qu’un essai réalisé dans ces conditions peut durer plus longtemps. Voir, par exemple, la
Référence [6] qui présente une étude du laps de temps écoulé avant que 50 % des animaux aux premiers
stades de la vie atteignent un stade copépodite pour différents régimes de température et de salinité.
8.5.5 Manipulation des récipients d’essai
Il convient que la manipulation des récipients d’essai soit aléatoire, sous peine de créer un biais qui
pourrait être pris pour un effet de la concentration. En particulier, si les unités expérimentales sont
manipulées dans l’ordre de traitement ou l’ordre de concentration, certains effets liés au temps, tels
que la fatigue ou toute autre erreur de l’opérateur, pourraient entraîner des effets plus importants aux
concentrations plus élevées. Il convient de faire attention à ce que les conditions environnementales,
telles que l’emplacement dans le laboratoire, soient uniformes pour tous les récipients d’essai,
indépendamment de leur position physique dans le dispositif d’essai. Il est également important de
souligner que tous les réplicats se voient allouer un temps de développement identique.
8.5.6 Alimentation
Il convient d’ajouter 5.0 × 10 cellules de Rhodomonas salina par millilitre au début de l’essai, ainsi qu’au
moment des renouvellements du milieu ou lors de l’addition de solution d’essai fraîche (voir 8.5.9 et
Tableau B.1). Il convient de consigner tout écart par écrit. Lorsque de petits volumes de la solution
d’essai sont utilisés dans les essais semi-statiques, il est important de considérer le volume de nourriture
distribué et la dilution de la concentration d’exposition. Il convient que le volume de nourriture apporté
représente au maximum 1 % du volume total. Des détails spécifiques des régimes d’alimentation sont
donnés au Tableau B.1.
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8.5.7 Lumière et température
Des détails spécifiques des régimes de lumière et de température à mettre en œuvre sont décrits à
l’Annexe G. Un cycle jour/nuit de 16 h de lumière suivies de 8 h d’obscurité est recommandé, à faible
-1 -2
intensité lumineuse (5 µmol à 10 µmol⋅s ⋅m ). La température utilisée doit être de (20 ± 1) °C pendant
toute la durée de la période d’exposition.
8.5.8 Aération
Si une aération est nécessaire pour maintenir la concentration en oxygène dissous (OD) supérieure à
70 % de la valeur de saturation dans l’air (VSA) (voir Article 9), il convient que l’aération des récipients
d’essai soit aussi réduite que possible afin d’éviter l’évaporation de l’eau et l’extraction des substances
chimiques d’essai.
8.5.9 Eau de dilution, renouvellement ou addition des solutions d’essai
La fréquence de renouvellement partiel ou d’addition des solutions d’essai dépend de la stabilité de la
substance d’essai, mais il convient qu’elle soit d’au moins une fois pour un essai durant de 5 jours à
6 jours et d’au moins une fois tous les 2 jours à 3 jours si l’essai dure plus longtemps. Si des essais de
stabilité préliminaires ou les propriétés physico-chimiques de la substance d’essai laissent à penser que
la concentration n’est pas stable (c’est-à-dire en dehors de la gamme des 80 % à 120 % de la concentration
nominale ou inférieure à 80 % de la concentration initiale mesurée) sur la période de renouvellement
maximale (c’est-à-dire 2 jours à 3 jours), il convient d’envisager des renouvellements plus fréquents des
solutions d’essai. Des données montrant que la concentration de la substance d’essai a été maintenue de
manière satisfaisante doivent être fournies (voir 8.6).
Le renouvellement de la solution d’essai s’effectue de différentes manières:
— une partie (50 % à 80 %) de l’ancienne solution d’essai peut être remplacée par de la solution
2)
d’essai fraîche ;
3)
— le volume peut être augmenté progressivement par addition de solution d’essai fraîche .
Une autre méthode pourrait consister à préparer une série de récipients d’essai contenant une solution
d’essai fraîche et à transférer les animaux dans ces récipients en disposant, par exemple, d’une chambre
intérieure dont le fond est garni d’un filet fin présentant une ouverture de mailles appropriée.
8.6 Mesurages/observations
Dans l’essai de développement larvaire, les nombres d’œufs non éclos, de nauplies (larves) et de
copépodites (juvéniles) doivent être enregistrés à la fin de la période d’exposition. Les animaux et les
œufs non éclos sont fixés dans une solution de Lugol et étudiés (comptés, mesurés, etc.). Étant donné
que la solution de Lugol peut également oxyder la substance chimique d’essai, des échantillons destinés
à l’analyse chimique doivent être prélevés avant d’ajouter la solution de Lugol, de préférence sur des
récipients séparés préparés exclusivement à cet effet (Annexe D). La coloration (de tous les animaux,
ainsi que leur mort) dans la solution de Lugol (voir Annexe D) facilite le comptage des animaux et des
œufs non éclos. Le comptage des différents stades de développement d’A. tonsa doit être facilité au
moyen d’un stéréomicroscope.
Il convient d’enregistrer sur des feuilles de collecte de données les observations réalisées durant l’essai.
Des exemples sont fournis à l’Annexe E.
2) La solution d’essai peut être prélevée au moyen d’un siphon muni d’un filet d’une ouverture de maille appropriée
pour éviter que des animaux ou des œufs soient retirés du récipient d’essai.
3) L’ajout de solution d’essai fraîche peut s’effectuer en augmentant progressivement le volume dans les récipients
d’essai, de 40 ml (par exemple) au début à 80 ml au jour 2 ou au jour 3.
8.6.1 Concentration de la substance d’essai
Durant l’essai, il convient de déterminer les concentrations de la substance d’essai à intervalles réguliers.
Il est recommandé d’analyser, au minimum, les concentrations d’essai maximale et minimale juste après
la préparation - au début de l’essai, immédiatement avant les renouvellements et à la fin de l’essai (c’est-
à-dire qu’il convient d’analyser des échantillons de concentration identique - juste après la préparation,
au moment des renouvellements et à la fin). Pour éviter que les échantillons destinés à l’analyse chimique
contiennent des matières biologiques et de la solution de Lugol, il est recommandé de prévoir trois
récipients supplémentaires de chaque concentration à des fins d’échantillonnage (sans organismes et
sans nourriture): un pour le prélèvement avant le premier renouvellement ou la première addition d’eau,
le deuxième pour le prélèvement après le premier renouvellement ou la première addition d’eau et le
dernier pour le prélèvement à la fin de l’essai. Au début, les échantillons destinés à l’analyse ont la même
provenance que ceux qui sont utilisés pour démarrer l’essai. Voir Annexe C.
S’il est démontré que la concentration de la substance soumise à essai a été maintenue de manière
satisfaisante dans les limites de ± 20 % de la concentration nominale/mesurée pendant toute la durée de
l’essai, les résultats peuvent alors être basés sur les valeurs nominales ou mesurées. Si l’écart par rapport
à la concentration nominale ou mesurée est supérieur à ± 20 %, il convient d’exprimer les résultats sous
forme de moyenne pondérée dans le temps (voir les préconisations concernant ce calcul à l’Annexe F).
Pour les essais dans lesquels la concentration de la substance d’essai n’est pas censée demeurer dans les
limites de ± 20 % de la concentration nominale, il est nécessaire d’échantillonner toutes les concentrations
d’essai (y compris les témoins) juste après la préparation et au moment du renouvellement. Une fois les
essais terminés, on analyse au moins les échantillons dont la concentration nominale est proche de la
CE , de la CE et de la CSEO. Dans ces cas, les calculs des concentrations d’effet sont basés sur les
10 50
concentrations mesurées et il convient d’exprimer les résultats sous forme de moyenne pondérée dans
le temps (voir les préconisations concernant ce calcul à l’Annexe F). À noter qu’il convient de prendre des
précautions lors des essais menés sur des substances très lipophiles (c’est-à-dire log⋅Kow > 5), et donc
peu solubles dans l’eau, dans le présent système d’essai (voir Référence [3]).L’utilisation de substances
radiomarquées peut fournir des informations primordiales sur la répartition dans le système d’essai, ce
qui peut faciliter le calcul des concentrations réelles.
8.6.2 Paramètres physico-chimiques – oxygène, pH, salinité et température
Il convient de mesurer l’oxygène dissous, le pH, la salinité et la température dans le témoin et dans toutes
les concentrations d’essai au début et à la fin de l’essai, ainsi qu’à chaque renouvellement de l’eau de
dilution. Ces mesurages doivent être effectués, au minimum, dans le témoin et dans la concentration
d’essai maximale. Il convient de préférence de surveiller la température en continu. Des récipients d’essai
supplémentaires (incluant des animaux et de la nourriture) peuvent être prévus exclusivement à cet effet.
9 Critères de validité
Pour que les résultats d’essai soient considérés comme valides, il convient que les critères de performance
suivants soient satisfaits:
— la concentration en oxygène dissous doit avoir été au moins égale à 70 % de la valeur de saturation
dans l’air (VSA) pendant toute la durée de l’exposition;
— il convient que la température ne varie pas de plus de ± 1 °C pendant toute la durée de l’essai;
— le pH du témoin ne doit pas s’écarter de plus de 1,0 unité du pH initial du témoin;
— la conductivité/salinité ne doit pas s’écarter de plus de 10 % de la valeur de départ du témoin (par
exemple (20 ± 2) ‰);
— les éclosions réussies dans le témoin doivent être supérieures ou égales à 75 %;
— dans les essais de développement larvaire, la fraction moyenne de copépodites (LDR) dans le témoin
doit représenter (60 ± 20) % des animaux comptés à la fin de l’exposition;
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— dans les essais de développement larvaire, le pourcentage moyen d’animaux survivants dans le ou
les témoins le jour de l’observation du taux de développement larvaire, par rapport aux animaux
éclos, doit être supérieur ou égal à 0,7;
— la CE du composé de référence 3,5-dichlorophénol (3,5-DCP) doit être comprise dans la gamme de
500 µg/l ± 300 µg/l pour les essais réalisés à 20 °C et avec une salinité de 20 ‰.
10 Expression des résultats
Une analyse de variance (ANOVA) à un facteur emboîté ou une technique d’analyse de régression est
utilisée pour évaluer les effets de la substance d’essai sur le développement des copépodes. L’analyse
de variance est une procédure paramétrique basée sur les hypothèses selon lesquelles les observations
sont indépendantes et normalement distribuées et la variance des observations est homogène sur toute
la plage des concentrations de la substance toxique et du témoin. Il convient de vérifier ces hypothèses
avant de mettre en œuvre l’ANOVA pour déterminer si elles ont été satisfaites. Les tests servant à valider
ces hypothèses sont le test de Shapiro-Wilk pour la normalité et le test de Bartlett pour l’homogénéité
[7]
de la variance . Si les données ne satisfont pas aux hypothèses requises pour l’ANOVA, des procédures
non paramétriques, telles que le test «Many-One-Rank» de Steel ou le test de la somme des rangs de
[7]
Wilcoxon, peuvent s’avérer plus appropriées. Différents programmes sont disponibles pour effectuer
une régression linéaire ou non linéaire en prenant une distribution normale logarithmique, une
distribution de Weibull ou une distribution logit des données.
Si un essai limite (comparaison du témoin et d’un seul traitement) a été réalisé et s’il remplit les conditions
préalables requises pour les procédures des tests paramétriques (normalité, homogénéité), les réponses
des deux groupes peuvent être évaluées au moyen du test de Student (test t). Si les conditions préalables
[8]
requises pour le test t ne sont pas remplies, un test t de variance inégale (tel que le test de Welch ) ou
[9]
un test non paramétrique tel que le test U de Mann-Whitney peut être utilisé. Le témoin et le témoin
solvant peuvent être comparés de la même manière.
Si
...
Questions, Comments and Discussion
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