ISO 12966-2:2017
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
ISO 12966-2:2017 specifies methods of preparing the methyl esters of fatty acids. It includes methods for preparing fatty acid methyl esters from animal and vegetable fats and oils, fatty acids and soaps. To cover different requirements, four methylation methods are specified, namely: a) a "rapid" transmethylation procedure under alkaline conditions; b) a "general" transmethylation/methylation procedure under sequential alkaline and acid conditions; c) a BF3 transmethylation procedure; d) an alternative procedure using acid-catalysed transmethylation of glycerides. Methyl esters so produced are used in various analytical procedures requiring such derivatives, e.g. gas-liquid chromatography (GLC), thin-layer chromatography (TLC) and infrared spectrometry (IR). Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this document.
Corps gras d'origines animale et végétale — Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras — Partie 2: Préparation des esters méthyliques d'acides gras
ISO 12966-2:2017 spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras. Il comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras à partir de corps gras d'origines animale et végétale, d'acides gras et de savons. Afin de répondre à différentes exigences, quatre méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir: a) une méthode de transméthylation «rapide» en conditions alcalines; b) une méthode de transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles; c) une méthode de transméthylation au BF3; d) une méthode alternative reposant sur la transméthylation par catalyse acide de glycérides. Les esters méthyliques ainsi obtenus sont utilisés dans diverses méthodes d'analyse exigeant des produits dérivés de ce type, par exemple la chromatographie gaz-liquide (CGL), la chromatographie sur couche mince (CCM) et la spectrométrie infrarouge (IR). Le lait et les produits laitiers (ou les matières grasses provenant du lait et des produits laitiers) ne font pas partie du domaine d'application du présent document.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12966-2
Second edition
2017-03
Animal and vegetable fats and oils —
Gas chromatography of fatty acid
methyl esters —
Part 2:
Preparation of methyl esters of fatty
acids
Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques d’acides gras —
Partie 2: Préparation des esters méthyliques d’acides gras
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ISO 2017
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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
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Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2017 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Reactions . 1
5 Methodology . 2
5.1 Preparation of test sample . 2
5.2 Rapid method . 2
5.2.1 Applicability . 2
5.2.2 Principle . 2
5.2.3 Reagents . 3
5.2.4 Apparatus . 3
5.2.5 Procedure . 3
5.3 General method . 4
5.3.1 Applicability . 4
5.3.2 Principle . 4
5.3.3 Reagents . 4
5.3.4 Apparatus and materials . 5
5.3.5 Procedure . 5
5.4 Transmethylation using boron trifluoride (BF ) catalyst . 6
5.4.1 Principle . 6
5.4.2 Applicability . 6
5.4.3 Reagents . 6
5.4.4 Apparatus . 7
5.4.5 Procedure . 8
5.5 Acid-catalysed transmethylation of glycerides . 9
5.5.1 Principle . 9
5.5.2 Reagents . 9
5.5.3 Apparatus .10
5.5.4 Preparation of test sample .10
5.5.5 Procedure .10
Annex A (informative) Thin-layer chromatography method for testing the completeness
of derivatization .11
Bibliography .15
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 12966-2:2011), of which it constitutes a
minor revision.
The changes compared to the previous edition are as follows:
— milk and milk fat products have been excluded from the scope.
A list of all the parts in the ISO 12966 series can be found on the ISO website.
iv © ISO 2017 – All rights reserved
Introduction
General
Oils and fats (i.e. liquid and solid lipids) are predominantly composed of fatty acid esters of glycerol
(triacylglycerols, TAGs), with smaller amounts of fatty acid esters of sterols and long chain of aliphatic
alcohols. Due to the high molecular mass of the TAGs and their consequent low volatility, they are
difficult to analyse directly by gas chromatography (GC), especially if a detailed analysis of unsaturated
fatty acids is required. Fatty acids themselves do not chromatograph well (except for short-chain-length
fatty acids, e.g. butanoic and pentanoic acids). It is therefore better practice to form fatty acid esters,
usually the fatty acid methyl esters (FAMEs), prior to GC.
The analysis of oils and fats has been extensively reviewed in Reference [9].
The formation of FAMEs is a critical stage in the analysis of fatty acids. Non-quantitative conversion
of fatty acids to FAMEs, modification of the structure of fatty acids (e.g. changes in positional and
geometric isomers present) and formation of non-FAME artefacts may all affect the quantitative
determination of fatty acid composition.
Transesterification is one mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acid esters in
fats (i.e. triacylglycerol). Alkali- or acid-catalysed transesterification procedures can be used to form
FAMEs in a methanolic medium; the procedure can be termed transmethylation. Transmethylation is
a reversible process and a large excess of methanol is required to maintain an equilibrium position
which favours formation of the FAMEs. Water can prevent the reaction going to completion, and its
presence should therefore be minimized. Alkali-catalysed procedures do not produce FAMEs from free
fatty acids, due to the formation of soaps.
Esterification is an acid-catalysed mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acids.
It is possible that the fatty acids are naturally present in the sample of fat under examination. Formation
of FAMEs by this mechanism is commonly termed methylation. Again, an excess of methanol and the
absence of water are preconditions for the quantitative formation of FAMEs.
This document provides guidelines for the preparation of fatty acid methyl esters. In support of these
guidelines, various procedures to prepare fatty acid methyl esters are specified. These include the
following:
a) “rapid” transmethylation under alkaline conditions;
b) “general” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions;
c) boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation.
“Rapid” transmethylation method under alkali-catalysed conditions
This method is applicable to the routine analysis of edible fats and oils containing fatty acids down to
butanoic acid (C4:0) and/or for the determination of butanoic acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using
an internal standard.
Alkaline catalysts transesterify neutral lipids in the presence of anhydrous methanol (transmethylation)
more rapidly than acid catalysts. The disadvantages of such alkali-catalysed procedures are that free
fatty acids are not esterified, and the presence of water may prevent the transmethylation going to
completion (hydrolysis of the FAMEs to free fatty acids). The most commonly used reagents are
potassium and sodium hydroxide and sodium methoxide in the presence of anhydrous methanol.
“General” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions
This method under sequential alkali- and acid-catalysed conditions is applicable to all oils and fats
including distillate and acid oils, but is not recommended for lauric oils. Short-chain fatty acid methyl
esters are easily lost during reflux. For lauric acid oils, the “rapid” transmethylation method is
recommended.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially
decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
Boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation
Owing to the toxicity of BF it is recommended that this method only be used in extremis
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12966-2
Second edition
2017-03
Animal and vegetable fats and oils —
Gas chromatography of fatty acid
methyl esters —
Part 2:
Preparation of methyl esters of fatty
acids
Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques d’acides gras —
Partie 2: Préparation des esters méthyliques d’acides gras
Reference number
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Reactions . 1
5 Methodology . 2
5.1 Preparation of test sample . 2
5.2 Rapid method . 2
5.2.1 Applicability . 2
5.2.2 Principle . 2
5.2.3 Reagents . 3
5.2.4 Apparatus . 3
5.2.5 Procedure . 3
5.3 General method . 4
5.3.1 Applicability . 4
5.3.2 Principle . 4
5.3.3 Reagents . 4
5.3.4 Apparatus and materials . 5
5.3.5 Procedure . 5
5.4 Transmethylation using boron trifluoride (BF ) catalyst . 6
5.4.1 Principle . 6
5.4.2 Applicability . 6
5.4.3 Reagents . 6
5.4.4 Apparatus . 7
5.4.5 Procedure . 8
5.5 Acid-catalysed transmethylation of glycerides . 9
5.5.1 Principle . 9
5.5.2 Reagents . 9
5.5.3 Apparatus .10
5.5.4 Preparation of test sample .10
5.5.5 Procedure .10
Annex A (informative) Thin-layer chromatography method for testing the completeness
of derivatization .11
Bibliography .15
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 12966-2:2011), of which it constitutes a
minor revision.
The changes compared to the previous edition are as follows:
— milk and milk fat products have been excluded from the scope.
A list of all the parts in the ISO 12966 series can be found on the ISO website.
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Introduction
General
Oils and fats (i.e. liquid and solid lipids) are predominantly composed of fatty acid esters of glycerol
(triacylglycerols, TAGs), with smaller amounts of fatty acid esters of sterols and long chain of aliphatic
alcohols. Due to the high molecular mass of the TAGs and their consequent low volatility, they are
difficult to analyse directly by gas chromatography (GC), especially if a detailed analysis of unsaturated
fatty acids is required. Fatty acids themselves do not chromatograph well (except for short-chain-length
fatty acids, e.g. butanoic and pentanoic acids). It is therefore better practice to form fatty acid esters,
usually the fatty acid methyl esters (FAMEs), prior to GC.
The analysis of oils and fats has been extensively reviewed in Reference [9].
The formation of FAMEs is a critical stage in the analysis of fatty acids. Non-quantitative conversion
of fatty acids to FAMEs, modification of the structure of fatty acids (e.g. changes in positional and
geometric isomers present) and formation of non-FAME artefacts may all affect the quantitative
determination of fatty acid composition.
Transesterification is one mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acid esters in
fats (i.e. triacylglycerol). Alkali- or acid-catalysed transesterification procedures can be used to form
FAMEs in a methanolic medium; the procedure can be termed transmethylation. Transmethylation is
a reversible process and a large excess of methanol is required to maintain an equilibrium position
which favours formation of the FAMEs. Water can prevent the reaction going to completion, and its
presence should therefore be minimized. Alkali-catalysed procedures do not produce FAMEs from free
fatty acids, due to the formation of soaps.
Esterification is an acid-catalysed mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acids.
It is possible that the fatty acids are naturally present in the sample of fat under examination. Formation
of FAMEs by this mechanism is commonly termed methylation. Again, an excess of methanol and the
absence of water are preconditions for the quantitative formation of FAMEs.
This document provides guidelines for the preparation of fatty acid methyl esters. In support of these
guidelines, various procedures to prepare fatty acid methyl esters are specified. These include the
following:
a) “rapid” transmethylation under alkaline conditions;
b) “general” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions;
c) boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation.
“Rapid” transmethylation method under alkali-catalysed conditions
This method is applicable to the routine analysis of edible fats and oils containing fatty acids down to
butanoic acid (C4:0) and/or for the determination of butanoic acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using
an internal standard.
Alkaline catalysts transesterify neutral lipids in the presence of anhydrous methanol (transmethylation)
more rapidly than acid catalysts. The disadvantages of such alkali-catalysed procedures are that free
fatty acids are not esterified, and the presence of water may prevent the transmethylation going to
completion (hydrolysis of the FAMEs to free fatty acids). The most commonly used reagents are
potassium and sodium hydroxide and sodium methoxide in the presence of anhydrous methanol.
“General” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions
This method under sequential alkali- and acid-catalysed conditions is applicable to all oils and fats
including distillate and acid oils, but is not recommended for lauric oils. Short-chain fatty acid methyl
esters are easily lost during reflux. For lauric acid oils, the “rapid” transmethylation method is
recommended.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially
decomposed:
a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
c) acetylenic fatty acids.
Boron trifluoride (BF ) transmethylation/methylation
Owing to the toxicity of BF it is recommended that this method only be used in extremis
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NORME ISO
INTERNATIONALE 12966-2
Deuxième édition
2017-03
Corps gras d’origines animale et
végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques
d’acides gras —
Partie 2:
Préparation des esters méthyliques
d’acides gras
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty
acid methyl esters —
Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
Numéro de référence
©
ISO 2017
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Réactions . 2
5 Méthodologie . 2
5.1 Préparation de l’échantillon pour essai . 2
5.2 Méthode rapide . 2
5.2.1 Applicabilité . 2
5.2.2 Principe . 3
5.2.3 Réactifs . 3
5.2.4 Appareillage . 4
5.2.5 Mode opératoire . 4
5.3 Méthode générale . 4
5.3.1 Applicabilité . 4
5.3.2 Principe . 5
5.3.3 Réactifs . 5
5.3.4 Appareillage et matériaux. 5
5.3.5 Mode opératoire . 6
5.4 Transméthylation à l’aide d’un catalyseur au trifluorure de bore (BF ). 6
5.4.1 Principe . 6
5.4.2 Applicabilité . 7
5.4.3 Réactifs . 7
5.4.4 Appareillage . 8
5.4.5 Mode opératoire . 8
5.5 Transméthylation par catalyse acide des glycérides .10
5.5.1 Principe .10
5.5.2 Réactifs .10
5.5.3 Appareillage .10
5.5.4 Préparation de l’échantillon pour essai .11
5.5.5 Mode opératoire .11
Annexe A (informative) Méthode de chromatographie sur couche mince pour vérifier l’état
complet de la dérivatisation .12
Bibliographie .16
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 12966-2:2011), qui a fait l’objet
d’une révision mineure.
Les modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivants:
— le lait et les matières grasses laitières ne font pas partie du domaine d’application.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 12966 est disponible sur le site web de l’ISO.
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
Introduction
Généralités
Les corps gras (c’est-à-dire les lipides liquides et solides) sont essentiellement composés d’esters d’acides
gras de glycérol (triacylglycérols, ou TAG), avec des quantités moindres d’esters d’acides gras de stérols
et d’alcools aliphatiques à longue chaîne. Du fait de leur masse moléculaire élevée et leur très faible
volatilité, les TAG sont difficiles à analyser directement par chromatographie en phase gazeuse (CG),
en particulier si une analyse détaillée des acides gras insaturés est requise. Les acides gras eux-mêmes
ne réagissent pas bien à la chromatographie (à l’exception des acides gras à chaîne courte tels que les
acides butyrique et valérique). La pratique recommandée consiste donc à former des esters d’acides
gras, généralement des esters méthyliques d’acides gras (EMAG), avant la CG.
L’analyse des corps gras a été étudiée de manière approfondie dans la Référence [9].
La formation d’EMAG constitue une phase essentielle de l’analyse des acides gras. La conversion non
quantitative des acides gras en EMAG, la modification de la structure des acides gras (par exemple les
changements dans les isomères géométriques et de position présents) et la formation d’artéfacts non-
EMAG peuvent toutes affecter la détermination quantitative de la composition en acides gras.
La transestérification est l’un des mécanismes qui peuvent être employés pour former des EMAG à
partir des esters d’acides gras présents dans des corps gras (triacylglycérol, par exemple). Des méthodes
de transestérification par catalyse alcaline ou acide peuvent être utilisées pour former des EMAG dans
un milieu méthanolique — cette méthode porte le nom de transméthylation. La transméthylation est
un processus réversible et de grandes quantités de méthanol sont nécessaires pour maintenir un état
d’équilibre favorisant la formation d’EMAG. La présence d’eau peut empêcher la réaction d’aller à son
terme, et il convient donc de la réduire au minimum. Les méthodes par catalyse alcaline ne produisent
pas d’EMAG à partir d’acides gras, en raison de la formation de savons.
L’estérification est un mécanisme à catalyse acide qu’il est possible d’employer pour former des EMAG
à partir d’acides gras. Les acides gras peuvent être naturellement présents dans l’échantillon de corps
gras analysé. La formation d’EMAG à l’aide de ce mécanisme est communément appelée méthylation.
À nouveau, une grande quantité de méthanol et l’absence d’eau sont des conditions préalables à la
formation quantitative d’EMAG.
Le présent document fournit des lignes directrices pour la préparation d’esters méthyliques d’acides
gras. Diverses méthodes de préparation d’esters méthyliques d’acides gras sont spécifiées en
complément de ces lignes directrices. Celles-ci comprennent:
a) la transméthylation «rapide» en conditions alcalines;
b) la transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles;
c) la transméthylation/méthylation au trifluorure de bore (BF ).
Transméthylation «rapide» en conditions de catalyse alcalines
Cette méthode s’applique à l’analyse de routine des matières grasses alimentaires contenant des acides
gras à partir de l’acide butyrique (C4:0) et/ou pour la détermination de l’acide butyrique ou de l’acide
hexanoïque (C6:0) par CG à l’aide d’un étalon interne.
Les catalyseurs alcalins transestérifient les lipides neutres en présence de méthanol anhydre
(transméthylation) plus rapidement que les catalyseurs acides. Les inconvénients liés à ces méthodes
par catalyse alcaline tiennent au fait que les acides gras libres ne sont pas estérifiés et que la présence
d’eau peut empêcher la transméthylation d’aller jusqu’à son terme (hydrolyse des EMAG en acides gras
libres). Les réactifs les plus couramment utilisés sont l’hydroxyde de potassium et de sodium, ainsi que
le méthoxyde de sodium en présence de méthanol anhydre.
© IS
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INTERNATIONALE 12966-2
Deuxième édition
2017-03
Corps gras d’origines animale et
végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques
d’acides gras —
Partie 2:
Préparation des esters méthyliques
d’acides gras
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty
acid methyl esters —
Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Réactions . 2
5 Méthodologie . 2
5.1 Préparation de l’échantillon pour essai . 2
5.2 Méthode rapide . 2
5.2.1 Applicabilité . 2
5.2.2 Principe . 3
5.2.3 Réactifs . 3
5.2.4 Appareillage . 4
5.2.5 Mode opératoire . 4
5.3 Méthode générale . 4
5.3.1 Applicabilité . 4
5.3.2 Principe . 5
5.3.3 Réactifs . 5
5.3.4 Appareillage et matériaux. 5
5.3.5 Mode opératoire . 6
5.4 Transméthylation à l’aide d’un catalyseur au trifluorure de bore (BF ). 6
5.4.1 Principe . 6
5.4.2 Applicabilité . 7
5.4.3 Réactifs . 7
5.4.4 Appareillage . 8
5.4.5 Mode opératoire . 8
5.5 Transméthylation par catalyse acide des glycérides .10
5.5.1 Principe .10
5.5.2 Réactifs .10
5.5.3 Appareillage .10
5.5.4 Préparation de l’échantillon pour essai .11
5.5.5 Mode opératoire .11
Annexe A (informative) Méthode de chromatographie sur couche mince pour vérifier l’état
complet de la dérivatisation .12
Bibliographie .16
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 12966-2:2011), qui a fait l’objet
d’une révision mineure.
Les modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivants:
— le lait et les matières grasses laitières ne font pas partie du domaine d’application.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 12966 est disponible sur le site web de l’ISO.
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Introduction
Généralités
Les corps gras (c’est-à-dire les lipides liquides et solides) sont essentiellement composés d’esters d’acides
gras de glycérol (triacylglycérols, ou TAG), avec des quantités moindres d’esters d’acides gras de stérols
et d’alcools aliphatiques à longue chaîne. Du fait de leur masse moléculaire élevée et leur très faible
volatilité, les TAG sont difficiles à analyser directement par chromatographie en phase gazeuse (CG),
en particulier si une analyse détaillée des acides gras insaturés est requise. Les acides gras eux-mêmes
ne réagissent pas bien à la chromatographie (à l’exception des acides gras à chaîne courte tels que les
acides butyrique et valérique). La pratique recommandée consiste donc à former des esters d’acides
gras, généralement des esters méthyliques d’acides gras (EMAG), avant la CG.
L’analyse des corps gras a été étudiée de manière approfondie dans la Référence [9].
La formation d’EMAG constitue une phase essentielle de l’analyse des acides gras. La conversion non
quantitative des acides gras en EMAG, la modification de la structure des acides gras (par exemple les
changements dans les isomères géométriques et de position présents) et la formation d’artéfacts non-
EMAG peuvent toutes affecter la détermination quantitative de la composition en acides gras.
La transestérification est l’un des mécanismes qui peuvent être employés pour former des EMAG à
partir des esters d’acides gras présents dans des corps gras (triacylglycérol, par exemple). Des méthodes
de transestérification par catalyse alcaline ou acide peuvent être utilisées pour former des EMAG dans
un milieu méthanolique — cette méthode porte le nom de transméthylation. La transméthylation est
un processus réversible et de grandes quantités de méthanol sont nécessaires pour maintenir un état
d’équilibre favorisant la formation d’EMAG. La présence d’eau peut empêcher la réaction d’aller à son
terme, et il convient donc de la réduire au minimum. Les méthodes par catalyse alcaline ne produisent
pas d’EMAG à partir d’acides gras, en raison de la formation de savons.
L’estérification est un mécanisme à catalyse acide qu’il est possible d’employer pour former des EMAG
à partir d’acides gras. Les acides gras peuvent être naturellement présents dans l’échantillon de corps
gras analysé. La formation d’EMAG à l’aide de ce mécanisme est communément appelée méthylation.
À nouveau, une grande quantité de méthanol et l’absence d’eau sont des conditions préalables à la
formation quantitative d’EMAG.
Le présent document fournit des lignes directrices pour la préparation d’esters méthyliques d’acides
gras. Diverses méthodes de préparation d’esters méthyliques d’acides gras sont spécifiées en
complément de ces lignes directrices. Celles-ci comprennent:
a) la transméthylation «rapide» en conditions alcalines;
b) la transméthylation/méthylation «générale» en conditions alcalines et acides séquentielles;
c) la transméthylation/méthylation au trifluorure de bore (BF ).
Transméthylation «rapide» en conditions de catalyse alcalines
Cette méthode s’applique à l’analyse de routine des matières grasses alimentaires contenant des acides
gras à partir de l’acide butyrique (C4:0) et/ou pour la détermination de l’acide butyrique ou de l’acide
hexanoïque (C6:0) par CG à l’aide d’un étalon interne.
Les catalyseurs alcalins transestérifient les lipides neutres en présence de méthanol anhydre
(transméthylation) plus rapidement que les catalyseurs acides. Les inconvénients liés à ces méthodes
par catalyse alcaline tiennent au fait que les acides gras libres ne sont pas estérifiés et que la présence
d’eau peut empêcher la transméthylation d’aller jusqu’à son terme (hydrolyse des EMAG en acides gras
libres). Les réactifs les plus couramment utilisés sont l’hydroxyde de potassium et de sodium, ainsi que
le méthoxyde de sodium en présence de méthanol anhydre.
© IS
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Questions, Comments and Discussion
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