ISO/TS 21569-6:2016

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-6
First edition
2016-11-01
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 6:
Real-time PCR based screening
methods for the detection of
cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA
sequences
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Partie 6: Méthodes de dépistage PCR en temps réel pour la détection
de séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
Reference number
©
ISO 2016
© ISO 2016, Published in Switzerland
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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ii © ISO 2016 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and materials . 2
5.1 General . 2
5.2 PCR reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Procedure. 3
7.1 Preparation of test samples . 3
7.2 Preparation of DNA extracts . 3
7.3 PCR setup . 3
7.4 Temperature-time programme . 4
8 Accept/reject criteria . 4
8.1 General . 4
8.2 Identification . 4
9 Validation status and performance criteria . 4
9.1 General . 4
9.2 Robustness . 5
9.3 Collaborative trial . 5
9.4 Sensitivity . 7
9.5 Specificity . 8
10 Test report . 9
Bibliography .10
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
A list of all the parts in the ISO/TS 21569 series can be found on the ISO website.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-6:2016(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 6:
Real-time PCR based screening methods for the detection
of cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA sequences
1 Scope
This document specifies a procedure for the detection of a DNA sequence of the modified cry1Ab/Ac
gene and a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the maize ubiquitin
promoter (Pubi) and the cry1Ab/Ac gene. The modified cry1Ab/Ac gene and the Pubi-cry construct are
frequently found in genetically modified Bt plants. Both detection methods are based on real-time PCR
and can be used for qualitative screening purposes. For identification and quantification of a specific
genetically modified plant (event) a follow-up analysis has to be carried out.
This document is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also be suitable for
the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of these
methods requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from the relevant matrix.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Quantitative nucleic acid based methods
ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
4 Principle
DNA is extracted from the test portion applying a suitable method (see ISO 21571). The DNA analysis
consists of two parts:
a) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target taxon

specific real-time PCR (according to ISO 21570, see also Reference [1];
b) detection of the cry1Ab/Ac and/or the Pubi-cry DNA sequence in a real-time PCR, see References [2]
and [3].
5 Reagents and materials
5.1 General
For the purpose of this document, only chemicals and water of recognized analytical grade, appropriate
for molecular biology shall be used. Unless stated otherwise, solutions should be prepared by dissolving
the corresponding reagents in water and be autoclaved. For all operations in which gloves are used, it
should be ensured that these are powder-free. The use of aerosol-protected pipette tips as protection
against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase, (for hot-start PCR).
5.2.2 PCR buffer solution, containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates
(dNTPs).
Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and
polymerases which lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Tables 1 and 2).
Table 1 — Oligonucleotides for detection of cry1Ab/Ac
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[2]
cry1Ab/Ac as target sequence :
Bt-F1(mod) 5’-gAg gAA ATg CgT ATT CAA TTC AAC-3’ 400 nmol/l
Bt-R 5’-TTC Tgg ACT gCg AAC AAT gg-3’ 400 nmol/l
a
Bt-P 5’-(FAM)-ACA TgA ACA gCg CCT TgA CCA CAg C-(NFQ)-3’ 100 nmol/l
a
FAM: 6-Carboxyfluorescein, NFQ: non-fluorescent quencher (dark quencher).
Table 2 — Oligonucleotides for detection of Pubi-cry
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[2]
Pubi-cry as target sequence :
Pubi-F2 5’-ATT TgC TTg gTA CTg TTT CTT TTg TC-3’ 300 nmol/l
Cry-rr-R 5’-TTg TTg TCC ATg gAT CCT CTA gAg T-3’ 600 nmol/l
a,b
Pubi-T2 5’- (FAM)- ACC CTg TTg TTT ggT gTT ACT TCT gCA-(NFQ)-3’ 100 nmol/l
a
FAM: 6-Carboxyfluorescein, NFQ: non-fluorescent quencher (dark quencher).
b
The Pubi-T2 probe is three bases shorter than the probe described in Reference [3] but identical specificity and
sensitivity is achieved.
2 © ISO 2016 – All rights reserved

Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes may be used for the probe if they can be shown to yield
similar or better results.
6 Apparatus
Requirements concerning apparatus and materials shall be according to ISO 21569. In addition to the
usual laboratory equipment, the following equipment is required.
6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of
fluorescence signals generated during PCR.
7 Procedure
7.1 Preparation of test samples
It should be ensured that the test portion used for DNA extraction is representative of the laboratory
sample, e.g. by grinding or homogenizing of the samples. Measures and operational steps to be taken
into consideration should be as described in ISO 21571 and ISO 24276.
7.2 Preparation of DNA extracts
Concerning the preparation of DNA from the test
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-6
Première édition
2016-11-01
Méthodes horizontales d’analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 6:
Méthodes de criblage par PCR en
temps réel pour la détection des
séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 6: Real-time PCR based screening methods for the detection of
cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA sequences
Numéro de référence
©
ISO 2016
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériaux . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Réactifs PCR . 2
6 Appareillage . 3
7 Mode opératoire. 3
7.1 Préparation des échantillons pour essai . 3
7.2 Préparation des extraits d’ADN . 3
7.3 Réaction PCR . 3
7.4 Programme d’amplification . 4
8 Critères d’acceptation/rejet . 4
8.1 Généralités . 4
8.2 Identification . 5
9 État de validation et critères de performance . 5
9.1 Généralités . 5
9.2 Robustesse . 5
9.3 Essai interlaboratoires . 5
9.4 Sensibilité . 7
9.5 Spécificité . 8
10 Rapport d’essai .10
Bibliographie .11
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
Une liste de toutes les parties de l’ISO/TS 21569 est disponible sur le site de l’ISO.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-6:2016(F)
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 6:
Méthodes de criblage par PCR en temps réel pour la
détection des séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détection d’une séquence d’ADN du gène cry1Ab/Ac modifié
et une méthode de détection de la séquence d’ADN de transition entre le promoteur de l’ubiquitine du
maïs (Pubi) et le gène cry1Ab/Ac. Le gène cry1Ab/Ac modifié et le construit Pubi-cry sont fréquemment
observés dans les plantes génétiquement modifiées contenant le gène Bt. Les deux méthodes sont
basées sur une méthode par PCR en temps réel et peuvent être utilisées à des fins de criblage qualitatif.
Pour l’identification et la quantification d’une plante génétiquement modifiée (événement) spécifique,
une analyse complémentaire doit être effectuée.
Le présent document est applicable à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Il peut être
également utilisé pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments pour animaux
et des semences. L’application de ces méthodes exige qu’une quantité adéquate d’ADN amplifiable soit
extraite de la matrice étudiée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
ISO 21570, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
4 Principe
L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée (voir l’ISO 21571). L’analyse
de l’ADN comprend deux parties:
a) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple au moyen d’une
PCR en temps réel spécifique pour le taxon cible (conformément à l’ISO 21570), voir également la
Référence [1];
b) détection de la séquence d’ADN cry1Ab/Ac et/ou la séquence d’ADN Pubi-cry par une PCR en temps
réel, voir les Références [2] et [3].
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités
Pour les besoins du présent document, seules des substances chimiques et de l’eau de qualité analytique
reconnue, appropriées pour la biologie moléculaire, doivent être utilisées. Sauf indication contraire,
il convient de préparer les solutions par dissolution des réactifs correspondants dans l’eau et par
traitement à l’autoclave. Pour toutes les opérations nécessitant le port de gants, il convient de s’assurer
que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination croisée, il est recommandé d’utiliser
des embouts de pipette protégés contre les aérosols.
5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable (pour PCR «à démarrage à chaud»).
5.2.2 Solution tampon pour PCR contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides
triphosphates (dNTP).
Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts
à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent
être également utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableaux 1 et 2).
Tableau 1 — Oligonucléotides pour la détection de la séquence cry1Ab/Ac
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2]
cry1Ab/Ac comme séquence cible :
Bt-F1(mod) 5’-gAg gAA ATg CgT ATT CAA TTC AAC-3’ 400 nmol/l
Bt-R 5’-TTC Tgg ACT gCg AAC AAT gg-3’ 400 nmol/l
a
Bt-P 5’-(FAM)-ACA TgA ACA gCg CCT TgA CCA CAg C-(NFQ)-3’ 100 nmol/l
a
FAM: carboxy-6-fluorescéine, NFQ: chromophore extincteur non fluorescent (Dark Quencher).
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés

Tableau 2 — Oligonucléotides pour la détection de la séquence Pubi-cry
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2]
Pubi-cry en tant que séquence cible :
Pubi-F2 5’-ATT TgC TTg gTA CTg TTT CTT TTg TC-3’ 300 nmol/l
Cry-rr-R 5’-TTg TTg TCC ATg gAT CCT CTA gAg T-3’ 600 nmol/l
a,b
Pubi-T2 5’- (FAM)- ACC CTg TTg
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-6
Première édition
2016-11-01
Méthodes horizontales d’analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 6:
Méthodes de criblage par PCR en
temps réel pour la détection des
séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 6: Real-time PCR based screening methods for the detection of
cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA sequences
Numéro de référence
©
ISO 2016
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériaux . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Réactifs PCR . 2
6 Appareillage . 3
7 Mode opératoire. 3
7.1 Préparation des échantillons pour essai . 3
7.2 Préparation des extraits d’ADN . 3
7.3 Réaction PCR . 3
7.4 Programme d’amplification . 4
8 Critères d’acceptation/rejet . 4
8.1 Généralités . 4
8.2 Identification . 5
9 État de validation et critères de performance . 5
9.1 Généralités . 5
9.2 Robustesse . 5
9.3 Essai interlaboratoires . 5
9.4 Sensibilité . 7
9.5 Spécificité . 8
10 Rapport d’essai .10
Bibliographie .11
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
Une liste de toutes les parties de l’ISO/TS 21569 est disponible sur le site de l’ISO.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-6:2016(F)
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 6:
Méthodes de criblage par PCR en temps réel pour la
détection des séquences ADN cry1Ab/Ac et Pubi-cry
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détection d’une séquence d’ADN du gène cry1Ab/Ac modifié
et une méthode de détection de la séquence d’ADN de transition entre le promoteur de l’ubiquitine du
maïs (Pubi) et le gène cry1Ab/Ac. Le gène cry1Ab/Ac modifié et le construit Pubi-cry sont fréquemment
observés dans les plantes génétiquement modifiées contenant le gène Bt. Les deux méthodes sont
basées sur une méthode par PCR en temps réel et peuvent être utilisées à des fins de criblage qualitatif.
Pour l’identification et la quantification d’une plante génétiquement modifiée (événement) spécifique,
une analyse complémentaire doit être effectuée.
Le présent document est applicable à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Il peut être
également utilisé pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments pour animaux
et des semences. L’application de ces méthodes exige qu’une quantité adéquate d’ADN amplifiable soit
extraite de la matrice étudiée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
ISO 21570, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
4 Principe
L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée (voir l’ISO 21571). L’analyse
de l’ADN comprend deux parties:
a) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple au moyen d’une
PCR en temps réel spécifique pour le taxon cible (conformément à l’ISO 21570), voir également la
Référence [1];
b) détection de la séquence d’ADN cry1Ab/Ac et/ou la séquence d’ADN Pubi-cry par une PCR en temps
réel, voir les Références [2] et [3].
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités
Pour les besoins du présent document, seules des substances chimiques et de l’eau de qualité analytique
reconnue, appropriées pour la biologie moléculaire, doivent être utilisées. Sauf indication contraire,
il convient de préparer les solutions par dissolution des réactifs correspondants dans l’eau et par
traitement à l’autoclave. Pour toutes les opérations nécessitant le port de gants, il convient de s’assurer
que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination croisée, il est recommandé d’utiliser
des embouts de pipette protégés contre les aérosols.
5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable (pour PCR «à démarrage à chaud»).
5.2.2 Solution tampon pour PCR contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides
triphosphates (dNTP).
Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts
à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent
être également utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableaux 1 et 2).
Tableau 1 — Oligonucléotides pour la détection de la séquence cry1Ab/Ac
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2]
cry1Ab/Ac comme séquence cible :
Bt-F1(mod) 5’-gAg gAA ATg CgT ATT CAA TTC AAC-3’ 400 nmol/l
Bt-R 5’-TTC Tgg ACT gCg AAC AAT gg-3’ 400 nmol/l
a
Bt-P 5’-(FAM)-ACA TgA ACA gCg CCT TgA CCA CAg C-(NFQ)-3’ 100 nmol/l
a
FAM: carboxy-6-fluorescéine, NFQ: chromophore extincteur non fluorescent (Dark Quencher).
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Tableau 2 — Oligonucléotides pour la détection de la séquence Pubi-cry
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2]
Pubi-cry en tant que séquence cible :
Pubi-F2 5’-ATT TgC TTg gTA CTg TTT CTT TTg TC-3’ 300 nmol/l
Cry-rr-R 5’-TTg TTg TCC ATg gAT CCT CTA gAg T-3’ 600 nmol/l
a,b
Pubi-T2 5’- (FAM)- ACC CTg TTg
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